[发明专利]一种长双歧杆菌及其筛选方法和二裂酵母发酵产物溶胞物的制备方法

权利要求书

1.一种长双歧杆菌，其特征在于，所述长双歧杆菌具有细胞修复、缓解炎症作用，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，株号Di4，于2021年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23160。

2.一种筛选权利要求1所述的长双歧杆菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1：样品采集，将样品经溶解和梯度稀释后加入到灭菌的平板中；

S2：配置样品培养基；

S3：将上述样品培养基倒入所述平板中混合，厌氧培养，挑选平板上菌落长势较好的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，筛选出具有过氧化氢耐受性的长双歧杆菌；

S4：将验证为长双歧杆菌的菌株在MRS固体培养基上划线，挑单克隆，进行基因序列比对，确保是长双歧杆菌后再重复以上划线步骤，直至得到无杂菌的单一长双歧杆菌。

S5：将上述得到的单一长双歧杆菌接到MRS液体培养基中，有氧培养，挑选其中长势最好的长双歧杆菌，备用。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述样品采集自健康婴儿粪便。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述样品培养基按照如下方法制备：向50-50℃的MRS培养基加入过氧化氢溶液，使培养基中起始的过氧化氢浓度为0.5mmol/L，即得到样品培养基。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述MRS培养基为：蛋白胨0.8-2％，牛肉膏0.5-2％，酵母膏0.25-0.8％，葡萄糖1.5-3％，柠檬酸胺0.1-0.3％，乙酸钠0.25-0.75％，吐温80 0.1％和琼脂2％，调节pH为6.3-6.8，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制得。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述厌氧培养条件为：温度22-40℃，时间16-48h。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S5中所述有氧培养条件为：温度22-40℃，时间16-48h。

8.一种根据权利要求1所述的长双歧杆菌制备二裂酵母发酵产物溶胞物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将长双歧杆菌接种到MRS固体培养基上，22-40℃下进行活化培养16-48h，得到活化的长双歧杆菌，将活化的长双歧杆菌接种到MRS液体培养基中，22-40℃下有氧培养16-48h，得到长双歧杆菌液，作为种子；

(2)将长双歧杆菌菌液接种于发酵液中进行发酵，得到长双歧杆菌发酵液；

(3)将发酵好的长双歧杆菌离心收集菌体，将菌体清洗后重悬，然后处理后灭菌，即制得二裂酵母发酵产物溶胞物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵液配方为：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，柠檬酸胺0.2％，乙酸钠0.5％，吐温80 0.1％，在发酵过程中用NaOH调节pH至6.8。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵条件为：温度25～37℃，时间20～50h；步骤(3)中采用生理盐水或者PBS清洗菌体，采用高压均质或加溶酶菌进行处理。