[发明专利]一种基于稀土上转换纳米探针的甲型流感病毒核酸标记方法

权利要求书

1.一种基于稀土上转换纳米探针的甲型流感病毒核酸标记方法；其特征是，包括如下步骤：

(1)取表面羧基化稀土上转换纳米颗粒溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺旋转过夜活化后离心后弃上清，加入ddH₂O重悬后加入链霉亲和素，旋转混匀后离心加入ddH₂O重悬即获得链霉亲和素化的稀土上转换纳米颗粒；

(2)向链霉亲和素化的稀土上转换纳米颗粒溶液中加入茎环，旋转反应后即获得用于标记病毒核酸的稀土上转换纳米探针；

(3)向培养犬肾细胞MDCK的小皿中加入甲型流感病毒放入二氧化碳培养箱中孵育；加入稀土上转换纳米探针后在共聚焦显微镜下观察细胞内稀土上转换纳米探针信号，在980nm激光激发下观察到稀土上转换纳米探针发出540nm绿色荧光；

(4)将甲型流感病毒与MDCK细胞共孵育至50％细胞死亡，收集细胞和上清于离心管中，通过反复冻融裂解细胞，离心后使用滤膜过滤后离心除去细胞碎片，通过蔗糖密度梯度离心后重悬即获得核酸被稀土上转换纳米探针标记的甲型流感病毒。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的比例范围是1～2:1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中表面羧基化稀土上转换纳米颗粒溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和(N-羟基琥珀酰亚胺)的比例范围是10～20mg/100μl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)ddH₂O重悬后以链霉亲和素：ddH₂O体积比为1～5:1000加入链霉亲和素。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(2)茎环DNA序列为5`Biotin-GCGACTTTCAGTTATTATGCCGTTGTATTTGTCGC-BHQ1 3`。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(2)茎环溶液和链霉亲和素化的稀土上转换纳米颗粒溶液的体积比例1～10:100。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(3)稀土上转换纳米探针溶液与犬肾细胞培养基体积比为1～4:500。