[发明专利]一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因工程菌的构建及其应用

说明书

本发明涉及一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶及其基因工程菌的构建。本发明提供了一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶，并提供了高效表达牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶的基因工程菌P.p(xyn‑N.f)，所述基因工程菌培养所产木聚糖酶的酶活性高达500.70IU/mL。与目前已经报道的厌氧真菌或其它木聚糖酶基因工程菌相比，本发明所述的基因工程菌P.p(xyn‑N.f)不仅实现了厌氧真菌木聚糖酶在好氧条件下的表达，而且提高了木聚糖酶的酶活；获得的木聚糖酶具有较宽的pH适用范围，在浆漂白、皮革制造、清洁剂、纺织品防褪色剂、染料、洗涤剂、饲料、生物燃料、脱墨剂等工业中具有重要的研究和应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶及其基因工程菌的 构建。

背景技术

木质纤维素是指包括三大组分(纤维素、半纤维素和木质素)的生物质。木质纤维素广 泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等农作物废弃物中。木聚糖是植物半纤维素的主要组 成部分，是具有高度分枝的杂糖，是仅次于纤维素的第二丰富的可再生资源，木聚糖的基本 结构单元是以β-1，4糖苷键或β-1，3糖苷键的多聚木糖链，植物来源不同，木聚糖支链组 成也不同，在D-木糖的第二位氧上连接D-葡萄糖醛酸或4-O-甲基葡萄糖醛酸，或在第三位 连接有L-阿拉伯呋喃糖，有些木糖还在第二位或第三位氧上发生乙酰化，支链能进一步被酯 化为酚酸，在细胞壁网状结构中与木聚糖和木质素进行交联。

木聚糖酶系是一类能降解木聚糖的酶系，包括β-1，4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L- 呋喃型阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酯键酚酸酯酶。其中，β-1，4- 内切木聚糖酶是最关键的酶，它通过水解木聚糖分子的β-1，4-糖苷键，将木聚糖水解为小寡 糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。β-木糖苷酶通过水解低聚木糖的末端 来催化释放木糖残基。另外，参与彻底降解木聚糖的还有α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、α-葡萄 糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶以及能降解木聚糖中阿拉伯糖侧链残基与酚酸(如阿魏酸或香 豆酸)形成的酯键的酚酸酯酶等侧链水解酶，它们作用于木糖与侧链取代基之间的糖苷键， 协同主链水解酶的作用，最终将木聚糖转化为它的组成单糖。木聚糖酶目前已经广泛应用在 生物漂白、去污洗涤、动物饲料、造纸、酿造、食品、纺织、环境、植物及中药提取等工业 中。

迄今为止，利用生物工程技术以大量生产木聚糖酶为主要目的的木聚糖酶基因克隆和表 达已经取得了较大进展，得到了更高活性、更大产率、更完整或具有特殊性质的木聚糖酶。 目前木聚糖酶基因已经被克隆并在大肠杆菌、酵母、乳酸菌和霉菌中获得表达。随着生物技 术的发展，有关木聚糖酶基因的克隆和表达的研究越来越深入，但是由于各种条件如耐热性 差，稳定性差等的限制，而且木聚糖酶基因在异源宿主中的表达要遇到蛋白水解酶和糖基化 等问题，因此真正转化为生产实践的基因工程菌还比较少。

瘤胃厌氧真菌可分泌高活性的纤维素酶，其活性甚至优于工业用菌株，但其产量有限， 加之瘤胃真菌厌氧发酵技术尚不完备，影响了瘤胃厌氧真菌木聚糖酶的大规模工业化应用。 大肠杆菌、酵母和家蚕生物反应器等各种表达系统都能用于木聚糖酶基因的表达，尤其是酵 母表达系能够加工修饰表达产物，背景蛋白少，且能将外源蛋白分泌至胞外，表达量高等优 点使其在生产上具有良好的实际应用价值。通过构建基因工程菌实现瘤胃厌氧真菌木聚糖酶 的大量表达、降低生产成本、提高木聚糖酶耐高温、高湿、高压、极端pH的稳定性是瘤胃 厌氧真菌木聚糖酶得以开发利用的重要途径，也是木聚糖酶工业化生产所急需解决的问题， 值得深入研究。