[发明专利]一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)D5Δstc17菌株及构建方法

权利要求书

1.一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)D5Δstc17菌株，其特征在于：所述杂色曲霉D5Δstc17菌株菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23209。

2.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)D5Δstc17菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)以杂色曲霉D5菌株的基因组为模板，利用引物扩增细胞色素P450单加氧酶基因上游序列和下游序列得到0.8kb-1.2kb上游片段和0.8kb-1.2kb下游片段，将上游片段和下游片段与潮霉素抗性基因融合得到敲除片段；细胞色素P450单加氧酶基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

(2)制备杂色曲霉D5菌株的原生质体；

(3)将敲除片段转化到原生质体获得转化子；

(4)培养转化子，之后通过筛选获得杂色曲霉阳性转化子，最后通过对杂色曲霉阳性转化子进行基因验证获得杂色曲霉D5Δstc17菌株。

3.根据权利要求2所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)D5Δstc17菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中的扩增条件为：94℃变性5min；95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸7min。

4.根据权利要求2所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)D5Δstc17菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的制备杂色曲霉D5菌株的原生质体具体为：接种杂色曲霉D5菌株于马铃薯固体培养基平板，30℃培养5-7天；挑取大小合适的菌块，打碎后接种于100mL液体马铃薯培养基中，30℃培养24h后过滤收集菌丝体；用0.8M氯化镁清洗菌丝体后，将菌丝体放入1％溶酶菌的酶解液中，30℃、100rpm酶解1-2h；过滤去除菌丝体，3000rpm离心30min后获得杂色曲霉D5菌株的原生质体。

5.根据权利要求2所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)D5Δstc17菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中的将敲除片段转化到原生质体获得转化子具体为：将杂色曲霉D5菌株的原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗，用适量的山梨醇溶液重悬原生质体，使其浓度达到10⁸个/mL；每150μL原生质体中加入10μL敲除片段、加入50μL 40％PEG4000，轻轻混匀，冰浴30min；加入1mL 40％PEG4000，混匀后室温放置10min，然后与15mL上层琼脂培养基混合后倾注于5个再生潮霉素筛选培养基平板上，30℃暗培养5d获得转化子。

6.根据权利要求2所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)D5Δstc17菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中的培养转化子，之后通过筛选获得杂色曲霉阳性转化子，最后通过对杂色曲霉阳性转化子进行基因验证获得杂色曲霉D5Δstc17菌株具体为：

将步骤(3)获得的转化子转接到筛选平板上，在30℃传代纯化5天，重复两次，之后随机挑选3株培养后的转化子收集菌丝提取基因组DNA,进行基因组PCR验证，获得杂色曲霉阳性转化子，最后将杂色曲霉阳性转化子进行单孢分离纯化，从中选3个单菌落再次进行基因组PCR验证；最终获得杂色曲霉D5Δstc17菌株。