[发明专利]一种NADH激酶突变体、编码基因及其应用

说明书

本发明涉及一种NADH激酶突变体及其编码基因，以及其在多酶偶联法生物合成L‑草铵膦、D‑氨基酸和L‑氨基丁酸中的应用。所述突变体为SEQ ID No.1所示的NADH激酶经下列之一的突变所得：(1)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H；(2)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A；(3)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A、第332位异亮氨酸I突变为赖氨酸K。本发明NADH激酶突变体具有更好的催化效率，以中间产物PPO为底物进行催化反应时，转化率远高于原始酶，L‑草铵膦产率也大幅提升，克服了化学法合成L‑PPT所具有的工艺步骤多、反应条件苛刻、手性原料昂贵等缺点，是一种高效、低成本且环境友好的生产方式。

技术领域

本发明涉及一种NADH激酶突变体及其编码基因，以及其在多酶偶联法生物合成L-草铵膦、D-氨基酸和L-氨基丁酸中的应用。

背景技术

手性氨基酸是应用广泛的手性化合物，在多肽和单对映体等活性药物中间体中具有重要意义。 利用生物酶法合成手性氨基酸具有操作简单、反应条件温和、产品收率高以及光学活性值高等优势，是目前手性氨基酸不对称合成的研究热点。利用氨基酸脱氢酶不对称还原前手性酮是最常见的方法，但氨基酸脱氢酶在不对称还原中需要消耗NADPH，由于NADPH价格昂贵，限制了其在工业水平的应用。采用酶偶联构建NADPH再生循环系统可以有效的解决NADPH限制，其中甲酸脱氢酶（FDH）、醇脱氢酶（ADH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）是最常用于NADPH再生的酶。甲酸脱氢酶构建的辅酶循环系统中，甲酸铵可同时作为甲酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶的胺供体，并且副产物 CO₂可由气体形式离开体系，简化了反应体系以及后续的分离纯化工艺。尽管构建了NADPH再生体系，但在实际的催化中需要加入一定量的NADP或NADPH驱动反应的进行。NADH激酶是一种催化NADH和ATP反应生成NADPH的磷酸化酶，由于NADH相对于NADPH更为便宜，使得NADH激酶在工厂实际应用中具有重要意义。

草铵膦 （D，L-PPT） 是一种有机磷除草剂，具有低毒，安全性高、广谱等优点。在市场方面所销售的草铵膦主要是外消旋草铵膦，但只有L-PPT能发挥除草作用，且能在土壤微生物的作用下迅速降解。D构型草铵膦不具有除草活性，且对土壤有一定的损害。若能将D-PPT转化为L-PPT，使销售的草铵膦产品能以仅含L-PPT的形式使用，可降低草铵膦产品的使用量和使用成本，同时减轻环境压力。

L-PPT可由化学法和生物法合成，目前工业法生产主要采用化学法。

化学法合成L-PPT具有工艺步骤多、反应条件苛刻、手性原料昂贵等缺点，从而导致产品收率低，生产成本高，并且不是一种绿色环保的制备方法。而生物法可以克服上述化学法的局限性，是一种高效、低成本且环境友好的生产方式。生物法主要有三种：

（1）酶直接水解L-草铵膦的衍生物，其优点在于转化率高，产物ee值较高，但所用原料为昂贵且不易获得的手性前体。

（2）酶的选择性拆分外消旋草铵膦，其优点在于原料相对易得，催化效率高，但是理论收率只能达到50％，极大地降低了原料利用率。

（3）以D，L-草铵膦为原料，先由D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦合成L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基（甲基）膦酰基]丁酸（简称PPO），再由氨基酸脱氢酶催化PPO得到L-草铵膦。该法的最大理论产率为100%，原料得到充分利用，因此相比于上述两种方法，该法在工业化生产中具有更广阔的应用前景。

利用生物酶法合成D-丙氨酸具有高效催化、绿色环保等特点。以丙酮酸为底物，在D-氨基酸脱氢酶的作用下生成D-丙氨酸，同时NADPH氧化为NADP，加入甲酸脱氢酶（FDH）又将NADP转化为NADPH构成循环体系，因此反应过程不需要源源不断地加入昂贵的NADPH。该方法成本较低、产品光学纯度高，适用于工业化大生产。