[发明专利]一种检测高半胱氨酸的比率型荧光探针的制备方法及其在细胞成像与生物传感中的应用

权利要求书

1.一种Hcy荧光探针，其特征在于，其结构如下式DCB所示：

2.一种Hcy荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将无水N,N-二甲基甲酰胺DMF和三氯氧磷进行第一反应得到油状物，然后加入有机溶剂和化合物1，在耐压管中进行第二反应，得到Hcy荧光探针DCB，所述反应过程如下反应式(a)所示：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一反应的温度为0℃-10℃；

和/或，所述第一反应的时间为10min-60min；

和/或，所述第二反应的温度为50℃-100℃；

和/或，所述第二反应的时间为10h-12h；

和/或，所述三氯氧磷、DMF、化合物1的摩尔比为150-300：150-300：1；

和/或，所述有机溶剂选自二氯甲烷或1,2-二氯乙烷。

4.如权利要求1所述的Hcy荧光探针在制备化合物2-4中的应用，其特征在于，具体制备步骤如下：

将如权利要求1所述的Hcy荧光探针DCB和3-巯基丙酸甲酯在乙腈中室温反应得到化合物2，所述反应过程如下反应式所示：

或，将如权利要求1所述的Hcy荧光探针DCB和3-巯基丙酸甲酯在乙腈中室温反应得到化合物3，所述反应过程如下反应式所示：

或，将如权利要求1所述的Hcy荧光探针DCB和正丁胺在乙腈溶剂中室温反应得到化合物4，所述反应过程如下反应式所示：

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述化合物2的制备中，所述DCB和3-巯基丙酸甲酯的摩尔比为1：1-1.2；所述反应的时间为10-60min；所述溶剂选自乙腈，二氯甲烷或1,2-二氯乙烷；所述碱选自三乙胺、DABCO或哌啶；所述碱的加入量为底物DCB的1-5mol％；

和/或，所述化合物3的制备中，所述DCB和3-巯基丙酸甲酯的摩尔比为1：2-5；所述反应的时间为30-90min；所述溶剂选自乙腈，二氯甲烷或1,2-二氯乙烷；所述碱选自三乙胺、DABCO或哌啶；所述碱的加入量为底物DCB的1-5mol％；

和/或，所述化合物4的制备中，所述DCB和正丁胺的摩尔比为1：2-10；所述反应的时间为30-90min；所述溶剂选自乙腈，二氯甲烷或1,2-二氯乙烷。

6.将如权利要求1所述的Hcy荧光探针用于在体外和/或细胞内检测Hcy中的应用；其中，所述细胞不包括来源于人的细胞。

7.如权利要求1所述的Hcy荧光探针在细胞成像与生物传感中的应用。

8.一种体外Hcy的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在乙腈和缓冲液混合溶液中，将如权利要求1所述的Hcy荧光探针与Hcy进行反应，然后用激发波长为405nm的波长激发，测定溶液的荧光强度，随着加入Hcy含量的增加，所述Hcy荧光探针本身的荧光强度逐渐降低，一个新的发射峰的荧光强度逐渐升高，呈比率型变化，有良好的线性，从而实现对Hcy的定量检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；和/或，所述乙腈和缓冲液的体积比为1-10：90-100；和/或，所述反应的温度为室温；和/或，所述反应的时间为30s-10min。

10.一种在细胞内Hcy的荧光成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将细胞与如权利要求1所述的Hcy探针共同孵育，之后加入缓冲液，然后利用共聚焦显微镜进行观察，用激发波长为405nm的波长激发，观察细胞在523nm发射荧光随着Hcy的不断增加，细胞中探针的523nm发射荧光逐渐降低，在548nm处的荧光逐渐增强，得到了一个比率响应，从而实现对细胞内Hcy的比率荧光响应并进行成像分析。