[发明专利]水稻BC20突变基因、重组载体、转化体及其在制备水稻脆杆突变体中的应用

权利要求书

1.一种水稻BC20突变基因，其特征在于，所述突变基因为：

突变体bc20-1，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

突变体bc20-2，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.一种权利要求1所述的水稻BC20突变基因所编码的蛋白，其特征在于，

所述突变体bc20-1所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述突变体bc20-2所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种用于制备权利要求1所述的水稻BC20突变基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为以下两条中的至少一种：

sgRNA1：核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

sgRNA2：核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.一种制备水稻BC20突变基因的重组载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

根据权利要求3所述的用于制备水稻BC20突变基因的的sgRNA，合成Oligo DNA引物，PCR扩增得到两个单独的靶位点片段；

通过限制性内切酶BsaⅠ 将两个靶位点片段酶切形成粘性末端后，混合两个靶位点片段，以T7连接酶连接，形成含有两个靶位点序列的片段；以此片段为模板进行PCR扩增得到含有两个靶位点的Oligo DNA产物，使用限制性内切酶FokⅠ 将新的片段进行酶切，得到含有粘性末端的Oligo DNA；

酶切带有Cas9基因的空载体得到线性化质粒；

混合含有两个靶位点的线性片段与线性化空载体，以T4连接酶连接，获得重组载体。

5.一种包含权利要求4所述方法制备得到的重组载体的转化体，所述转化体为大肠杆菌细胞和农杆菌细胞中的一种。

6.权利要求1所述的水稻BC20突变基因和/或权利要求2所述的蛋白和/或权利要求4所述方法制备得到的重组载体和/或权利要求5所述的转化体在制备水稻脆杆突变体中的应用。

7.水稻脆性基因BC20和/或其编码蛋白在水稻脆杆突变体育种中的应用，其特征在于，所述水稻脆性基因BC20的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示；所述水稻脆性基因BC20所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。