[发明专利]一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，是利用同源重组的方式在酿酒酵母中整合表达MVA途径限速酶‑截短形式的HMG‑CoA还原酶编码基因(tHMG1)和整合融合表达FPP合酶编码基因(ERG20)与瓦伦烯合成酶编码基因(SmVS)，以增强MVA途径代谢强度，增强瓦伦烯的表达。同时使用铜离子诱导启动子pCUP1替换角鲨烯合酶编码基因ERG9启动子，下调麦角固醇竞争途径，提高瓦伦烯产量；最终获得高产瓦伦烯的基因工程菌株。该基因工程菌的瓦伦烯的摇瓶发酵产量可达到约117mg/L，发酵罐产量可达到约8g/L，完全具备商业化生产水平，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

瓦伦烯(Valencene)，分子式：C₁₅H₂₄，又名瓦伦西亚烯，巴伦西亚橘烯，朱栾倍半萜，是一种倍半萜烯，是柑橘类水果和柑橘类香精的主要香气成分，主要通过冷榨柑橘类水果皮获得。瓦伦烯作为香料，广泛应用于食品、化妆品行业，同时又可以作为前体分子来生产诺卡酮(Nootkatone)，诺卡酮通常是通过瓦伦烯的化学或生物化学氧化从葡萄柚中提取的，有很高的的经济价值和药用价值。

瓦伦烯可以从植物中分离提取，但提取步骤繁琐，且质量与原料息息相关，又因为瓦伦烯的场景运用往往与人接触密切，经化学方法合成的瓦伦烯在运用上受到极大限制。除此之外，微生物发酵也是瓦伦烯的一个来源，微生物发酵法生产的瓦伦烯相对安全，而且生产具有条件温和，不受地理和气候影响和容易进行大规模生产等优势。

目前生物发酵生产瓦伦烯的菌株主要是利用转化了瓦伦烯合成酶的大肠杆菌工程菌和酿酒酵母菌工程菌，但产量都偏低，在10mg/L左右，远没有达到工业生产的水平。而且大肠杆菌发酵生产的时候会产生内毒素，后期不好分离，生产用在与人密切接触的瓦伦烯，处于劣势。而酿酒酵母是国际公认的安全模式菌株且遗传操作方法成熟，有天然的优势。因此，构建高产稳定的瓦伦烯酿酒酵母生产菌株，具有重要的经济价值和社会意义。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

步骤S1，构建酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块：过表达tHMG1模块，包括诱导型双向强启动子pGAL1-10和MVA途径限速酶编码基因tHMG1，所述pGAL1-10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如 SEQ NO.2所示；

步骤S2，构建瓦伦烯生产相关基因表达模块：ERG20-Linker-SmVS模块，包括FPP合酶的编码基因ERG20和瓦伦烯合成酶的编码基因SmVS，所述 ERG20的核苷酸序列如SEQNO.3所示，所述SMVS的核苷酸序列如SEQ NO.4 所示；

步骤S3，构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌：将步骤S1 所述酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块和步骤S2所述瓦伦烯生产相关基因表达模块整合至半乳糖调节蛋白GAL80基因位点，同时敲除半乳糖调节蛋白 GAL80基因，得到敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块，将所述敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块转化至构建的酿酒酵母基因工程菌GS-A3中，经多次基因工程操作，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌；

步骤S4，构建角鲨烯合酶途径下调表达质粒，包括将铜离子诱导启动子 pCUP1替换为角鲨烯合酶基因ERG9启动子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；所述角鲨烯合酶基因ERG9启动子取至ERG9基因起始密码子前 450bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示；