[发明专利]一种重组牛干扰素融合蛋白及其应用

说明书

本发明提供了一种重组牛干扰素融合蛋白，包含牛扰素α和蓖麻毒素B链，所述牛扰素α为牛干扰素突变体蛋白mBoIFNα，所述蓖麻毒素B链为截短的蓖麻毒素B链蛋白RTBD1，所述mBoIFNα是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白，优选的将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第32位和/或第83位氨基酸突变为精氨酸或组氨酸。本发明提供的牛干扰素重组融合蛋白比普通牛干扰素α半衰期长、生物学活性高，降低了干扰素制剂的制备成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及由牛干扰素α重组蛋白及其制备方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是机体在感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应从而产生的糖蛋白，干扰素在抗病毒复制活性上具有突出优势，可以增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活性，调节宿主免疫功能，发挥其抗病毒作用。根据产生干扰素的来源不同、理化性质不同、生物活性不同以及识别受体不同，IFN分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型干扰素还可分为IFN-α、IFN-β和IFN-α，Ⅰ型干扰素抗病毒活性较强。

目前大型哺乳动物Ⅰ型干扰素类细胞因子药物应用发展进程较慢。现有的牛干扰素多属于单一的α型或β型，但在临床中存在半衰期短、体内易降解等难题，研制安全有效的牛IFN-α融合蛋白制剂具有重大意义。

发明内容

为了克服现有技术中的不足本发明提供了一种重组牛干扰素融合蛋白，包含牛扰素α和蓖麻毒素B链，所述牛扰素α为牛干扰素突变体蛋白mBoIFNα，所述蓖麻毒素B链为截短的蓖麻毒素B链蛋白RTBD1，所述mBoIFNα是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。分别对于野生型和突变蛋白做柔性分析,如果突变区域蛋白柔性提升，则将该区域的一个或几个氨基酸作为突变位点，突变为极性氨基酸。

所述极性氨基酸具有亲水性，提高蛋白等电点和稳定性，通过本发明所选择的位点进行突变，改变了天然蛋白的二硫键，制备得到的突变蛋白在保存过程中不易产生沉淀。本发明所选择的突变位点，突变蛋白与野生型蛋白相比，三维结构没有发生变化，从而维持了蛋白的生物学功能。

优选的是，所述mBoIFNα是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第32位和/或第83位氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。

上述任一项优选的是，所述极性氨基酸包括精氨酸或组氨酸的至少一种。

上述任一项优选的是，其特征在于，所述RTBD1的氨基酸序列为Seq ID NO：2所示氨基酸序列中的第n位至m位氨基酸，其中n＝1，2，3或4，m≥134。

蓖麻毒素B链(Ricin toxin，RTB)没有毒性且具有增强机体免疫反应的功能。本发明进一步优选的将牛IFNα与RTBD1截短肽组成融合蛋白获得长效牛干扰素，可增强牛干扰素抗病毒活性，提高干扰素在机体血液中蛋白稳定性，进而提高干扰素于机体内药物半衰期。优选的，所述蓖麻毒素B链蛋白的氨基酸序列包括Seq ID NO：2所示的氨基酸序列，优选的，使用截短的蓖麻毒素B链蛋白，截短方式包括将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列第1位氨基酸敲除、第1、2位氨基酸敲除、第1至3位氨基酸敲除；和/或将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列第135至263位氨基酸序列敲除、第136至263位氨基酸序列敲除、第137至263位氨基酸序列敲除、第138至263位氨基酸序列敲除、第139至263位氨基酸序列敲除、第140至263位氨基酸序列敲除、……、第260至263位氨基酸序列敲除、第261至263位氨基酸序列敲除、第262至263位氨基酸序列敲除、第263位氨基酸序列敲除。本发明所优选的蓖麻毒素B链截短肽减小蛋白分子大小，增加在体内组织的渗透率。

上述任一项优选的是，截短的蓖麻毒素B蛋白为RTBD1，RTBD1的氨基酸序列如SeqID NO：18所示。