[发明专利]一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞同时表达MSLN-CAR和PD1抗体；

其中，所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQ NO.1所述；

所述表达的MSLN-CAR和PD1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所述；

核酸序列如SEQ ID NO.9所述。

2.根据权利要求1所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞，其特征在于，所述MSLN-CAR包括信号肽、胞外区、铰链区、跨膜区、共刺激信号域及胞内信号结构域。

3.根据权利要求2所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞，其特征在于，

所述的信号肽为CD8a信号肽，其氨基酸序列如SEQ NO.2所述；

所述胞外区为靶向mesothelin的scfv，其氨基酸序列如SEQ NO.3所述；

所述铰链区为CD8a，其氨基酸序列如SEQ NO.4所述；

所述跨膜区为CD8a，其氨基酸序列如SEQ NO.5所述；

所述共刺激信号域为4-1BB，其氨基酸序列如SEQ NO.6所述；

所述胞内信号结构域为CD3zeta，其氨基酸序列如SEQ NO.7所述。

4.如权利要求1-3所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：

(1)、构建携带MSLN-CAR及PD1抗体核酸序列的重组慢病毒质粒；

(2)、将携带MSLN-CAR及PD1抗体的的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒；

(3)、从供者提供的外周血中分离PBMC，使用磁珠分离、活化T细胞；

(4)、将制备的可感染T细胞的重组慢病毒感染T细胞，产生表达MSLN-CAR的同时分泌PD1抗体的CAR-T细胞；

(5)、将得到的CAR-T细胞进行体外培养；

(6)、将进行了体外培养的CAR-T细胞进行扩增；

(7)、收集表达MSLN-CAR的同时分泌PD1抗体的CAR-T细胞。

5.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述重组慢病毒质粒是：重组后的复制缺陷型慢病毒质粒，能将外源片段整合入宿主基因；所述重组慢病毒质粒是二代或三代的慢病毒转基因质粒。

6.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述制备可感染T细胞的重组慢病毒载体具体是：重组慢病毒载体将靶向MSLN的嵌合受体表达在T细胞表面，同时分泌PD-1抗体；

其中，所述的PD-1抗体为人PD-1抗体。

7.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的宿主细胞是：293FT或293T细胞。