[发明专利]一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用

权利要求书

1.一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料，其特征在于：该纳米材料为Fe₃O₄@mSiO₂@TiO₂，具有球形结构；其中，球形结构的核心为用于提供磁性的四氧化三铁，四氧化三铁的外层包裹用于蛋白质酶解的介孔二氧化硅层，介孔二氧化硅层外部包覆用于磷酸化肽富集的二氧化钛层。

2.一种权利要求1所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1）、将三氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠充分溶解于乙二醇中100~170℃下搅拌，将形成的黑色反应液转移至高压反应釜，并将反应釜置于置于100~200℃烘箱反应8~16小时，冷却至室温，磁滞分离收集产物，用无水乙醇、去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；

步骤（2）、将步骤（1）所得的产物超声均匀分散于无水乙醇中，加入去离子水、氨水，超声混匀得分散液，再加入正硅酸四乙酯，搅拌5~20小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇、去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；

步骤（3）、将步骤（2）所得的产物、十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺超声均匀分散在去离子水中，50~100℃搅拌1~5小时，加入正硅酸四乙酯和异丙醇的环己烷混合液，搅拌5~20小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，然后50~100℃下在硝酸乙醇溶液中回流，再次磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；

步骤（4）、将步骤（3）所得的产物在溶剂中，超声分散均匀，加入二氧化钛前驱体，20~80℃搅拌反应 5~10小时，磁滞分离收集产物，用去离子水和乙醇洗涤然后真空干燥；即得纳米材料。

3.根据权利要求2所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，三氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠的质量比为：(2~4)：(3~10)：(1~1.5)。

4.根据权利要求2所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，步骤（1）所得产物和无水乙醇的质量体积比为1：1000；正硅酸乙酯与分散液的体积比为1：(300~400)。

5.根据权利要求2所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，步骤（2）所得的产物、十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺的质量比为1：30：(1~2)；环己烷混合液中包含5wt% 的正硅酸四乙酯和2.5wt%的异丙醇；产物在硝酸乙醇溶液中回流次数为3~5次。

6.根据权利要求2所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，步骤（3）所得的产物与二氧化钛前驱体的质量比为(10~20)：1；其中，二氧化钛前驱体为钛酸四异丙酯、钛酸正丁酯、硫酸钛或四氯化钛中的一种或几种的混合；在加入二氧化钛前驱体前，还加入氢氧化钠、碳酸钠或氨水中的一种或几种。

7.权利要求1所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料在非标记磷酸化蛋白质组定量分析中的应用，其特征在于，定量分析的具体步骤为：

步骤一、将金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料置于溶剂中配制成分散液；

步骤二、在分散液中加入蛋白质溶液，混合，再加入胰蛋白酶，37℃孵育；最后加入三氟乙酸和乙腈，室温振荡孵育；

步骤三、将步骤二所得溶液通过外加磁场分离出纳米材料，用缓冲液洗涤，除去非磷酸化肽段，再加入氨水37℃下振荡洗脱，取洗脱液点靶，自然干燥进行质谱分析。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤一中，分散液的浓度10~30 mg/mL；溶剂采用25 mM的碳酸氢钠溶液。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤二中，胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1：50~1：200；37℃孵育时间为1~16小时；室温振荡孵育时间为10~30分钟。

10.根据权利7所述的应用，其特征在于：所述步骤三中，缓冲液包含15 mM的碳酸氢铵，20~50wt%的乙腈和0.5~5wt%的三氟乙酸。