[发明专利]一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法

权利要求书

1.一种大片段敲除质粒pBJ116，其特征在于，是将pilA基因的启动子片段P_pilA和sacB基因的ORF片段融合获得P_pilA-SacB的模块，扩增出四环素抗性基因，获得P_tet-TCR模块，将P_pilA-SacB模块和P_tet-TCR模块构建到pBJ113载体的BamHI和XbaI位点，获得质粒pBJ116；

所述的pilA基因的启动子片段P_pilA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的sacB基因的ORF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的四环素抗性基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

2.根据权利要求1的大片段敲除质粒pBJ116，其特征在于，所述的大片段敲除质粒pBJ116的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1或2所述的大片段敲除质粒pBJ116在敲除目的片段中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，大片段敲除质粒pBJ116在敲除黄色黏球菌中目的片段中的应用。

5.一种大片段敲除的方法，其特征在于，设定待敲除基因的上游同源臂和下游同源臂序列，扩增后，将上游同源臂插入质粒pBJ116的P_pilA-SacB模块的前面，将下游同源臂插入质粒pBJ116的P_tet-TCR模块的后面，获得敲除质粒，将敲除质粒转入宿主菌中与待敲除基因发生同源重组，利用卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，筛选获得敲除待敲除基因的宿主菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌是黄色黏球菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的待敲除基因是MyxochelinA编码基因MXAN_3618。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体的步骤为：

构建MXAN_3618基因的上游同源臂MyxA-Up-flank，利用引物MyxA-1和MyxA-2扩增上游同源臂1-2；同时利用引物MyxA-3和MyxA-4扩增上游同源臂3，以上游同源臂1-2和上游同源臂3为模板，利用MyxA-1和MyxA-4引物进行PCR扩增，获得上游同源臂的融合片段MyxA-Up-flank，利用同源重组将这该片段构建到pBJ116质粒的SacI和BamHI位点，获得pBJ116-MyxA(Up)质粒；利用引物MyxA-5和MyxA-6扩增下游同源臂2，利用引物MyxA-7和MyxA-8扩增下游同源臂3-4，以下游同源臂2和下游同源臂3-4为模板，利用MyxA-5和MyxA-8引物进行PCR扩增，获得下游同源臂的融合片段MyxA-Down-flank，利用同源重组将这该片段构建到pBJ116-MyxA(Up)质粒的XbaI和SalI位点，从而获得pBJ116-MyxA敲除质粒；将连接的质粒转化到大肠杆菌中，提取pBJ116-MyxA敲除质粒；

制得黄色黏球菌DK1622感受态，将pBJ116-MyxA敲除质粒转化到黄色黏球菌DK1622感受态中，利用含卡那霉素的培养基筛选，获得单交换菌株，再利用含半乳糖的培养基筛选双交换菌株，然后用含四环素的培养基筛选，再利用含有蔗糖的培养基筛选，获得基因MXAN_3618敲除的黄色黏球菌；

9.敲除黄色黏球菌的MyxochelinA编码基因ΔMXAN_3618在降低黄色黏球菌捕食铜绿假单胞菌中的应用。