[发明专利]基于DNA载体和复制型痘苗病毒载体的新冠病毒复合型疫苗

说明书

本发明提供了一种同时表达新冠病毒S基因的胞外区段和N基因全长区段的重组痘苗病毒，本发明还提供了含有所述重组痘苗病毒，以及表达新冠病毒的S基因的胞外区段的DNA载体和表达新冠病毒N基因全长区段的DNA载体的免疫接种试剂盒作为复合型疫苗的应用。通过使用本发明提供的复合型疫苗中的三种疫苗在0、2、4周的顺序接种可以诱导实验动物产生针对新冠病毒N，S1，S2蛋白特异的CD4，CD8细胞反应，且CD8T细胞反应高于CD4T细胞反应，诱导的T细胞免疫可持续至少3个月，结合抗体持续至6个月未见明显下降，表明复合疫苗可以诱导针对SARS‑CoV‑2持久的免疫应答，该疫苗诱导的中和抗体具有交叉反应活性，可在一定程度上预防新冠病毒多种变异株的感染。

技术领域

本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及DNA-痘苗病毒载体复合型新冠疫苗，其能够诱导高水平的抗新型冠状病毒的体液和细胞免疫应答，预防新型冠状病毒感染。

背景技术

新冠肺炎的病原体是新型冠状病毒-2(SARS-CoV-2)，在本发明中也被简称为新冠病毒。SARS-CoV-2属于冠状病毒科的β-冠状病毒属，是一类有囊膜的单股正链RNA病毒，具有较高的突变率，其基因组长度约为30kb。基因组的前2/3是非结构基因ORF1a/b，主要编码与病毒复制相关的酶(RNA依赖的 RNA聚合酶，RdRp)，后1/3依次编码四种结构蛋白：刺突蛋白(S)，包膜蛋白(E)，膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。自2021年1月首次发现B.1.1.7(alpha)变异株后，全球相继报道了B.1.351(beta)，P.1(gamma)以及B.1.617.2(Delta) 等变异株。变异株的突变位点大多集中在刺突蛋白的受体结合区、剪切位点等，突变提高了病毒的复制能力，与受体结合的亲合力，从而增强了病毒的感染力，最终降低了现有COVID-19疫苗的保护效果。

冠状病毒表面刺突蛋白(spike protein,S蛋白)是决定病毒嗜性和进入宿主细胞的关键蛋白，由S1和S2两个亚基组成。S1亚基的RBD(receptor-binding domain，受体结合域)与受体ACE2蛋白结合，S2介导病毒包膜与细胞膜的融合。现有已上市COVID-19疫苗，包括灭活疫苗、亚单位疫苗、mRNA疫苗以及腺病毒疫苗，除灭活疫苗包含多种病毒抗原外，其他疫苗均仅包含S 蛋白或S基因。迄今发现的SARS-COV-2的S基因突变，已使现有疫苗的保护效果大打折扣。因此，要诱导更强大的免疫应答，疫苗需包含除S蛋白外更多的结构蛋白。

在SARS-CoV-2的自然感染过程中，先前的感染只能减轻NHP和雪貂的临床症状，不能预防再次感染。大多数人感染SARS-CoV-2后，体内出现的抗体在半年后逐渐消减，而T细胞反应存在时间相对较长。有研究表明，SARS 感染者的T细胞反应可持续17年之久。由于新冠病毒特异的中和抗体持续存在时间可能较短，诱导持久的T细胞免疫反应才是广谱有效疫苗的关键所在。

N蛋白(nucleocapsidprotein)是冠状病毒的核衣壳蛋白，不仅能诱导特异的抗体,还能诱导特异的细胞毒T细胞活性。核衣壳蛋白(N)在小鼠和家兔有很强的免疫原性，诱导的T细胞免疫与动物来源冠状病毒有交叉反应性。SARS 感染者体内的N特异性T细胞与SARS-CoV-2的N蛋白有交叉反应也进一步支持了这一观点。因此，N基因可诱导持久且具有交叉反应活性的细胞免疫，可作为复合新冠疫苗的重要抗原。

鉴于现有技术新冠病毒疫苗还存在着免疫保护持续时间短，保护力度低，以及缺乏对变异毒株的广谱保护，本发明的目的在于提供针对新冠病毒感染的基于DNA载体和复制型痘苗病毒载体的新冠病毒复合型疫苗，以解决现有技术存在的问题。

发明内容