[发明专利]一种提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法。所述的方法包括(1)获取蒙古沙冬青外植体；(2)农杆菌选择与活化；(3)农杆菌的二次活化；(4)农杆菌侵染外植体；(5)毛状根诱导和繁殖；(6)扩大培养；通过所述的方法，可获得可生产芒柄花素的毛状根；所述的毛状根生产芒柄花素的含量得到显著提升，较野生植株提高了14倍；本发明所述的蒙古沙冬青毛状根具有生长快速，周期短，不受季节限制，次级代谢产物相对产量高等优点，可用于工业化生产蒙古沙冬青芒柄花素。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法。

背景技术

沙冬青(Ammopiptantus mongolicus(Maxim.ex kon)Chengf.)又名蒙古沙冬青、大沙冬青，属于豆科蝶形花亚科沙冬青属，是我国荒漠地区唯一的超旱生常绿阔叶灌木树种，被国家列入第1批珍稀濒危保护植物名录。据《中药辞海》、《全国中草药汇编》、《内蒙古植物药志》中记载，沙冬青是传统的民族药材(蒙药)，名“孟和哈日嘎讷”，其枝叶可入药，具有祛风湿、活血、散瘀、止痛的功效，外用还能治疗冻疮、尤其用于治疗风湿性关节炎疾病效果显著。研究表明，沙冬青的乙醇提取物具有良好的体内降血糖活性，从沙冬青种子中提取出抗癌物质JA1对小鼠肿瘤、人肝癌细胞具有明显抑制作用，沙冬青茎秆提取物可以抑制小菜蛾幼虫生长，沙冬青地上部水提物1g/L及以上都对松材线虫具有很好的杀虫效果。沙冬青的化学成分相对比较复杂，从沙冬青中分离提取的化合物主要有生物碱类、黄酮及异黄酮类、有机酸、二苯乙烯类、甾醇及单萜类等，具有抗肿瘤、抗病毒、杀菌、抗氧化、杀虫等作用功效。但是由于沙冬青自然条件下生长缓慢，幼苗存活率很低，缺乏自然更新能力，移植苗根再生力又弱，又由于人为放牧及樵砍破坏，使得这一珍贵荒漠树种日渐稀少，难以发挥其优势。因而，无论从保护濒危物种而言，还是从进一步发掘该物种宝贵资源而言，深入系统地对沙冬青进行种质资源保育扩繁及创新、次生代谢产物开发利用、功能基因挖掘、蛋白组及代谢组等研究势在必行。

毛状根(Hairy root)，是由发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物植株或某一器官、组织产生大量毛状根的表现型。毛状根体系具有激素自养、遗传稳定强、生长速度快以及次生代谢合成能力强等特点，是生产药用植物次生代谢产物的一条有效途径，并为实现次生代谢产物的工业化生产提供了可能；另外，毛状根具备自主生长的特性，还可以诱导为再生植株，能够在后代再生中保持遗传稳定，为分子改良育种提供支持。通常亲本植株能合成的次生代谢物均可利用毛状根来生产，且次生代谢产物的产量往往高于植物自身所能合成的量。利用毛状根生物反应器生产活性物质的方法即可不占用土地又可保护野生资源，是濒危资源可持续发展的有效途径。

发根农杆菌是一种寄主非常广泛的土壤细菌，能够侵染几乎所有的双子叶植物和少数的单子叶植物。发根农杆菌的Ri质粒被广泛的应用于植物基因工程、植物次生代谢产物的生产、植物品种改良和植物的栽培中。其转化植物产生的毛状根有如下优点：1)毛状根具有生长迅速，激素自主性，2)可以方便的转入外源基因，3)Ri质粒转化的植物的毛状根分化正常植株的频率高，倍性稳定，容易建成系列，4)无性系拥有亲本特征次级代谢途径，且次生代谢产物的生产能力高、含量稳定，5)毛状根来源于一个单细胞，为优良系的筛选提供了极大的方便。