[发明专利]一种mRNA检测方法

说明书

本发明公开了一种mRNA检测方法，包括以下步骤：设计反转录引物，反转录引物包括3’‑5’依次排列的第一区段和第二区段，第一区段与待检测的mRNA序列3’端互补，第二区段为特殊设计序列，且该第二区段与mRNA模板的任意一条链都不互补；设计下游引物，下游引物序列与反转录引物的第二区段一致；设计上游引物，上游引物为待测的mRNA与反转录引物互补位点的上游；将反转录引物、上游引物和下游引物加入反转录荧光定量PCR体系中，进行反转录得到反转录产物；将得到的反转录产物进行荧光定量PCR，得到终产物。彻底解决无法设计跨内含子引物的RNA反转录荧光定量PCR会被其编码DNA干扰的问题，可以解决RNA特异性扩增的问题。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，尤其是涉及一种mRNA检测方法。

背景技术

mRNA的检测在分子生物学领域有着很重要的应用。mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。

在大部分真核生物中DNA分为编码区和非编码区，其中，编码区通常包含外显子和内含子，在转录时，外显子和内含子都被转录到mRNA前体hnRNA中，随后，在hnRNA剪接成为成熟的mRNA时，内含子被切除，而外显子则得以保留。因此，成熟的mRNA序列相比于其编码的基因组DNA缺少了内含子序列。而在原核生物和部分低等真核生物细胞中mRNA无内含子结构，转录出的RNA无需进行剪切即为成熟的mRNA。其mRNA序列和基因组DNA序列一致。

在对RNA进行反转录荧光定量PCR检测时，对于有内含子的基因所编码的RNA我们通常会设计跨内含子的引物。其原理是跨内含子引物无法与编码相应RNA的DNA结合，因此在PCR扩增时，仅会特异性得扩增RNA。这种方法具有非常好的特异性，可以解决绝大多数DNA对RNA反转录荧光定量PCR的干扰，但是在某些情况下，例如内含子附近的DNA存在简单重复序列或高级结构而无法满足设计引物的要求，则无法设计出跨内含子的引物，通常是因为内含子附近的DNA；另外，原核生物和部分低等真核生物基因组中通常也不具备内含子，因此，基于上述情形，所述的引物设计方法不再适用。

目前，人们为了解决DNA的干扰做出了很多的努力，例如放弃免提取核酸的反转录荧光定量PCR，改为先提取待测样本的总核酸，然后再用DNA酶去除总核酸中的DNA，最后再进行反转录荧光定量PCR的试验方案。上述的试验方案虽然在理论上是可行的，但在实际应用中，即使用DNA酶消化数小时，体系内依旧会有DNA残留，又由于PCR极高的灵敏性，最终还是会干扰RNA的检测。另外，上述试验方案增加了操作步骤、延长了检测时间，提高了样本污染的风险。

为了解决上述技术问题，亟需设计一种针对无法设计跨内含子引物的RNA反转录荧光定量PCR方法，不仅要彻底去除基因组DNA的干扰，同时还要保证不引进操作步骤和新的风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对无法设计跨内含子的mRNA、有效去除基因组DNA干扰的mRNA检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种mRNA检测方法，包括以下步骤：

设计反转录引物，所述反转录引物包括3’-5’依次排列的第一区段和第二区段，所述第一区段与待检测的mRNA序列3’端互补，所述第二区段为特殊设计序列，且该第二区段与mRNA模板的任意一条链都不互补；

设计下游引物，所述下游引物序列与所述反转录引物的第二区段一致；

设计上游引物，所述上游引物为待测的mRNA与反转录引物互补位点的上游；

将所述反转录引物、上游引物和下游引物加入反转录荧光定量PCR体系中，进行反转录得到反转录产物；

将得到的所述反转录产物进行荧光定量PCR，得到终产物。