[发明专利]一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用

说明书

本发明公开了一种烟草NtCLC‑f基因突变体及分子鉴定方法和应用，所述烟草NtCLC‑f基因突变体为Ntclc‑f，其为烟草NtCLC‑f基因第1003位的C突变为T，形成终止密码子，使该基因提前终止；所述基因突变体Ntclc‑f的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本发明通过系统研究，首次提出了一种烟草NtCLC‑f基因突变体及分子鉴定方法和应用，本发明提出的降低烟草烟叶中氯离子含量的NtCLC‑f基因突变体Ntclc‑f获得的烟草植株，烟叶中氯离子含量比对照降低28.6％，使烟叶的氯离子含量显著降低。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用。

背景技术

氯离子含量是烟草中重要的质量参数，烟叶中的氯离子含量以0.3％～0.8％作为合适，如果烟叶中氯离子含量过高，会影响卷烟制品的燃烧性，会造成卷烟制品的阴燃，从而会使卷烟制品的烟气中具有更多的一氧化碳及焦油，这样会危害消费者的健康。并且当氯离子含量更高的时候，会直接造成熄火的现象。

目前我国在种植蔬菜和粮食作物的时候，会使用大量的化肥农药，现在的化肥中含量大量的氯离子，而这些含有氯离子的化肥在使用的过程中会造成耕作土壤中氯离子含量的超标。而土壤氯离子含量的超标会造成栽培作物过量的吸收氯离子从而造成作物体内的氯离子含量超标，这样会影响农作物的品质。

为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，采用低氯含量化肥是最直接的手段，但是考虑到低氯化肥的生产成本要显著的高于高氯含量化肥，因此化肥生产厂家与农民考虑到成本的因素，往往不会使用低氯化肥而使用高氯离子含量的化肥。另外现在中国的耕作土壤中氯离子含量超标已经较为严重，即便现在开始使用低氯离子含量的化肥也不能很快的解决作物尤其是烟草中氯离子超标的问题；因此传统的农艺措施很难改变目前烟叶中氯离子超标的问题。

因此，鉴于以上情况，有必要研究一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用以解决上述技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于获得降低烟草烟叶中氯离子含量的烟草NtCLC-f基因突变体，第二个目的在于提供烟草NtCLC-f基因突变体Ntclc-f的分子鉴定方法，第三个目的在于上述烟草NtCLC-f基因突变体在降低烟草烟叶中氯离子含量的应用。

本发明的第一个目的是这样实现的，所述烟草NtCLC-f基因突变体为Ntclc-f，其为烟草NtCLC-f基因第1003位的C突变为T，形成终止密码子，使该基因提前终止；所述基因突变体Ntclc-f的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。

本发明的第二个目的是这样实现的，NtCLC-f基因突变体Ntclc-f的分子鉴定方法，所述突变体Ntclc-f的DNA片段是由以下引物对扩增得到，所述引物对的上游引物为NtCLC-fF，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；下游引物为NtCLC-fR，其核苷酸序列如SEQID N0.4所示。

本发明的第三个目的是这样实现的，所述的烟草NtCLC-f基因突变体Ntclc-f在降低烟草烟叶中氯离子含量的应用。

本发明还提供一种NtCLC-f基因突变体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

1、EMS诱变烟草种子：

先将烟草种子用次氯酸钠清洗消毒，然后用蒸馏水洗干；再将烟草植株用磷酸缓冲液浸泡，以增加种子的萌发率；将浸泡获得的烟草种子放置于0.5％的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液中浸泡10-15小时，然后进行离心滤干烟草种子。将离心滤干的烟草种子用蒸馏水漂洗50次，充分洗去EMS溶液，将EMS废液用氢氧化钠处理，以免造成污染。

2、筛选获得突变体植株：

首先提取突变体烟草DNA；以突变体材料的DNA为模板设计特异引物进行PCR扩增；