[发明专利]一种引入非天然氨基酸的嵌合体苯丙氨酸翻译系统及其构建方法

权利要求书

1.一种引入非天然氨基酸的嵌合体苯丙氨酸翻译系统的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)以核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的嵌合体苯丙氨酸-tRNA为基础，构建嵌合体苯丙氨酸-tRNA的文库；

(2)筛选嵌合体苯丙氨酸-tRNA突变体，并测试筛选到的苯丙氨酸-tRNA突变体引入非天然氨基酸的效率；

(3)选择嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶的催化结构域、构建随机突变文库，筛选催化活性提高的嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体，获得非天然氨基酸插入活性提高的突变体；

(4)选择嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶识别4-叠氮-苯丙氨酸(AzF)和3-苯并噻吩基-丙氨酸(BTA)的氨基酸，构建饱和诱变文库，筛选高信噪比的嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体，所述突变体的基因序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；

(5)将步骤(2)中筛选得到的嵌合体苯丙氨酸-tRNA突变体和步骤(3)中筛选得到的嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体整合，获得包含嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶、苯丙氨酸-tRNA突变体和非天然氨基酸的翻译系统。

2.如权利要求1所述的构建方法，其中所述非天然氨基酸选自由3-苯并噻吩基-丙氨酸(BTA)、6-甲基-色氨酸(6MW)、7-甲基-色氨酸(7MW)、4-叠氮-苯丙氨酸(AzF)、4-乙酰基-苯丙氨酸(AcF)、2-萘基-丙氨酸(NapA)、叔丁氧羰基-赖氨酸(BocK)和3-硝基-酪氨酸(3NT)组成的组中的一种或多种。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其中步骤(2)中筛选得到的嵌合体苯丙氨酸-tRNA突变体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2～7所示。

4.如权利要求1～3任一项所述的构建方法，其中步骤(3)中筛选得到的嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示。

5.如权利要求1～4任一项所述的构建方法，其中，通过使用两个拷贝的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的嵌合体苯丙氨酸-tRNA突变体，实现引入非天然氨基酸效率达到细胞内源天然氨基酸插入的水平。

6.如权利要求1～5任一项所述的构建方法，其中，在选自由FLUC、ADK、TyrRS、UBE2K、Neo2/15、PHD和GID4组成的组中的任一种蛋白质上引入非天然氨基酸的效率能够达到野生型蛋白的表达水平。

7.如权利要求1～6任一项所述的构建方法，其中步骤(5)中所述包含嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶、苯丙氨酸-tRNA突变体和非天然氨基酸的翻译系统的基因序列分别如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO：4所示。

8.利用权利要求1～7任一项所述的构建方法构建得到的AzF依赖的大肠杆菌菌株。

9.利用权利要求1～7任一项所述的构建方法构建得到的嵌合体苯丙氨酸翻译系统。

10.根据权利要求9所述的翻译系统，其特征在于，所述翻译系统与Mj-TyrRS/tRNA系统以及Ma-PylRS/tRNA系统具备交互正交性和/或所述翻译系统能够整合到大肠杆菌的基因组上。