[发明专利]一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其合成方法和应用

权利要求书

1.一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求2所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）设计并合成上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4；

2）提取绿盲蝽总RNA并反转录获取cDNA模板；

3）利用步骤1）合成的上下游引物和步骤2）获取的cDNA模板，通过RCR反应获得绿盲蝽GRK基因序列。

4.绿盲蝽GRK基因的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.权利要求4所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）PCR扩增目的基因片段：在绿盲蝽GRK基因的dsRNA核苷酸序列的两端加上与L4440载体的同源序列，设计并合成上游引物如SEQ ID NO.6所示和下游引物如SEQ ID NO.7所示，以GRK基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，纯化PCR产物得到目的基因片段；

2）重组菌株的构建：用同源重组酶连接步骤1）纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体得到重组载体并进行表达得到重组菌株；

3）诱导表达：将步骤2）得到的重组菌株诱导表达得到菌体；

4）dsRNA的提取和纯化：提取菌体的总RNA，加入RNase A和DNaesⅠ去除单链RNA和基因组DNA，得到PCR产物；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇溶液，振荡，离心取上清；加入乙醇，充分混匀，静置，离心弃上清；用乙醇洗涤，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水溶解，获得纯化后的dsRNA。

6.根据权利要求5所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，步骤1）所述L4440载体序列为SEQ ID NO.8所示。

7.根据权利要求5所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，步骤3）所述诱导培养基为LB液体培养基，菌液和诱导培养基按1：50~1：100的比例接种。

8.根据权利要求5所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，步骤4）中所述RNase A的终浓度为1~10 μg/mL，所述DNaesⅠ的终浓度为 0.1~1 μg/μL 。

9.权利要求4所述的绿盲蝽GRK基因的dsRNA在防治绿盲蝽中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是通过显微注射仪将dsRNA注射进绿盲蝽体内抑制绿盲蝽GRK基因的表达。