[发明专利]大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了大肠杆菌‑芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用，该穿梭质粒载体包括pTC、pBE、pTN和pTK中的任意一种，序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示。本发明从PUC19出发获得大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性的基因片段，从pMarA出发获得芽孢杆菌温敏复制起点和卡那霉素抗性和红霉素抗性的基因片段，从pBEST502和pSG1164中分别获得新霉素抗性基因和氯霉素抗性基因，经过酶切和酶链接构建了大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体。本发明中的四个质粒载体可在不同芽孢杆菌中穿梭、共存以及消除，避免质粒发生漂移对环境产生污染，可潜在应用于外源蛋白的表达，实现对芽孢杆菌基因组DNA的编辑。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性菌是一种极具潜力的外源蛋白表达宿主菌，利用表面或噬菌体外壳蛋白的膜锚定结构域序列构建基因融合，将重组蛋白靶向到噬菌体或细胞表面。不论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体，都展现出其他细菌无可比拟的优势，是研究较多、应用广泛的生物安全菌。随着对枯草芽孢杆菌研究的深入，外源蛋白在穿梭质粒载体构建系统中的表达已经引起越来越多学者的兴趣。枯草芽孢杆菌作为表达系统，优点在于可以高效表达具有生物学活性的异源蛋白，并将其分泌到培养基中，从而有利于产物的纯化回收。

质粒是外源蛋白异源表达的必须工具，目前，可用于外源蛋白在B.subtilis 中表达的质粒虽然不少，但含有不同的抗性标记基因的穿梭质粒载体，很少有人报道。

穿梭质粒载体具有两类不同生物来源的复制起点和遗传标记基因，它可以克服两类生物在遗传上的障碍，并在这两类生物中自主复制和表达相应的遗传标记基因，穿梭质粒载体具备的特殊性能，一直是基因工程领域研究的热点。现有技术中相继构建成了大肠杆菌--金黄色葡萄珠菌穿梭质粒载体pHV33和大肠杆菌-- 芽抱杆菌穿梭质粒载体pJKK502以及革兰氏阴性菌--革兰氏阳性菌穿梭表达质粒载体pREP9等,刘成君构建了大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4。虽然目前已经构建出很多穿梭质粒载体，但存在的问题也是参差不齐，有的只含有单一抗生素标记位点，有的在大肠杆菌中转化效率高，但在芽孢杆菌中转化效率低。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体，包括一系列可在不同芽孢杆菌中共存，穿梭及进行消除的穿梭质粒载体，可解决现有多数穿梭质粒载体宿主范围窄，不容易消除等问题。

本发明还提供所述大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体的构建方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体，包括大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体pTC、pBE、pTN和pTK中的任意一种，其碱基序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。

其中，所述pTC穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因Amp^R和用于芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因Cl^R和人工合成多克隆位点MCS。

其中，所述pBE穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因Amp^R和用于芽孢杆菌筛选的红霉素抗性基因Erm^R和人工合成多克隆位点MCS。

其中，所述pTN穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因Amp^R和用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因Neo^R和人工合成多克隆位点MCS。