[发明专利]一种活体示踪神经连接的腺相关病毒及其应用

说明书

本发明公开了一种可用于活体快速示踪脑神经结构连接的腺相关病毒及其应用，采用腺相关病毒突变血清型AAV2‑retro作为病毒载体，装载水通道蛋白基因（AQP1）和荧光蛋白报告基因（EGFP），选择优化的外源基因表达框元件包装成重组腺相关病毒载体rAAV2‑retro‑CAG‑AQP1‑2A‑EGFP‑WPRE‑pA，用于活体快速检测大脑结构神经连接。在活体动物感染重组病毒三周后，在注射位点及其上游结构连接脑区检测到扩散加权MRI信号的改变，并与离体组织切片水平观测到的荧光信号有较好一致性，实现了脑结构神经连接的活体可视化，利用H₂O扩散产生的MRI对比作为观测指标，相较于金属离子，毒性更低且更灵敏。

技术领域

本发明属于病毒载体技术领域，具体涉及一种活体示踪神经连接的腺相关病毒及其应用。

背景技术

人脑是自然界最为复杂的系统之一，它由数以千亿计的神经元和胶质细胞组成，而突触把神经元连接起来形成神经回路或网络。研究大脑神经回路是理解大脑工作机制，治疗精神疾病，模拟大脑功能以及优化人工智能工作的基础。嗜神经病毒是一类经人工改造的，可以侵染神经系统并标记神经环路的病毒，具有高效感染神经细胞，并沿神经环路跨突触传播、标记信号不衰减的特性。通过对病毒基因组进行改造，如敲除特定毒性基因，携带荧光marker、光敏感蛋白等探针，获得减毒、高效的重组示踪工具病毒。目前常用于神经科学研究的工具病毒主要包括：腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)、慢病毒(lentivirus,LV)、狂犬病毒(rabies virus,RV)、伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitisvirus,VSV)等。常用的神经标记方法是让嗜神经病毒携带荧光蛋白在脑组织中表达，一段时间后，利用显微光学成像技术在离体组织切片中观察。但是，光学成像技术难以对全脑进行观测，仅能研究表面浅层的脑结构与功能，并且无法显示基因在活体中的表达水平。

磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)技术，综合了无损性、无侵入性、高穿透性、较高的时空分辨率，多方位和多参数成像等优势，在人类脑结构和功能研究方面均取得了迅速的发展，广泛应用于基础生物学研究和临床医学诊断。MRI在其生物分子工具方面主要集中在体现合成造影剂特性的生物分子上，如顺磁离子、超顺磁纳米颗粒和化学交换基质，或通过在细胞中积累这些造影剂，从而改变水质子或其附近其他原子核的磁共振信号。这些生物报告分子使得MRI可视化以前看不见的过程，如基因表达、细胞迁移和神经传递。目前研究较多的顺磁离子如Fe²⁺，Mn²⁺，Gd²⁺等，这些金属离子的富集使得弛豫增强，从而改变T1或T2的加权信号。造影剂的使用可以进一步增强MRI信号强度，增加信号对比度，但是高于一定浓度的金属离子对机体有较强的毒性，影响动物正常生理功能甚至直接造成动物死亡。

扩散加权成像(DWI)是一种无创的MRI技术，反映了水分子的表观扩散运动。DWI技术在扩散加权成像过程中通过连续多个不同梯度的b值获得水分子通过不同方式进行跨膜运动的具体信息。水通道蛋白是一类具有高度选择性的跨膜转运蛋白，以四聚体的形式富集于细胞膜上，能够显著增加细胞膜的通透性，对维持细胞内外水平衡及稳定细胞微环境具有重要作用。由于水分子的转运速率与b值呈倒数关系，通过超高b值DWI获得表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)来反映细胞膜上AQP蛋白的表达及功能。据文献报道，过度表达1型水通道蛋白(AQP1)来促进跨膜的水交换将引起DWI信号的对比度增强。AQP1有较高灵敏度，可以在较低浓度(500nM)下检测到。作为无金属报告分子，水通道蛋白不受金属生物利用度的限制，不需要金属离子或其螯合物，从而规避了金属离子具有较强毒性的问题。