[发明专利]从非神经元细胞转化制备中型棘突神经元的方法及用途

权利要求书

1.一种从非神经元细胞转化制备中型棘突神经元的方法，其特征在于，所述非神经元细胞为成纤维细胞，该方法包括：

（1）构建含有细胞转分化基因组合的病毒载体，并通过转染试剂进行病毒包装，所述病毒为逆转录病毒、慢病毒或AAV病毒；

（2）培养供体源细胞，并用包装后的病毒感染所述供体源细胞；

（3）在诱导分化培养液中将所述供体源细胞转分化为中型棘突神经元，所述诱导分化培养液中包括促进转分化的小分子化合物和生长因子；

（4）分离纯化所述中型棘突神经元；

其中，所述细胞转分化基因组合为以下基因的组合：（1）选自NGN2和ASCL1中的至少一种基因；（2）LHX6, CTIP2；（3）选自DLX1, DLX2中的至少一种基因；以及（4）选自SOX4和SOX11中的至少一种基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促进转分化的小分子化合物包括福司可林，环磷酸腺苷, 双丁酰环磷酸腺苷, 视黄酸, LDN-193189 , SB431542, CHIR99021中的至少两种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长因子包括bFGF2, GDNF, NT3,BDNF中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞转分化基因组合中的基因来源于人或小鼠等其它任何种属同源基因。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒载体中用于调控表达水平的启动子为CMV, CAG, EF1α, PGK, TRE Tight, TRE3G中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体源细胞为任何年龄的正常人或患者的非神经元细胞，所述非神经元细胞包括：皮肤成纤维细胞、肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述培养供体源细胞包括：采用包被基质预包被培养皿，所述供体源细胞预种于预包被后的培养皿中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被基质包括：层粘连蛋白、明胶、纤维粘连蛋白、基质凝胶中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述供体源细胞在所述培养皿中的接种密度为1.0×10³-5.0×10⁴个/cm²。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离纯化所述中型棘突神经元，包括：所述供体源细胞在所述诱导分化培养液中转分化得到的中型棘突神经元经过胰蛋白酶消化并重悬成单细胞悬浮液，再用细胞微滤器、流式细胞仪或在明胶包被的培养皿上差异性贴壁的方法分离得到高纯度中型棘突神经元。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离纯化所述中型棘突神经元后，该方法还包括：

经过分离纯化获得的部分高纯度中型棘突神经元接种在预先包被好的培养皿中，用中型棘突神经细胞培养液继续培养；或

经过分离纯化获得的高纯度中型棘突神经元冷冻于冻存液中储存、运输。

12.一种根据权利要求1~11任一项所述的方法制备的中型棘突神经元在建立用于筛选HD治疗药物的方法中的用途。