[发明专利]一种获得耐盐大麦加倍单倍体的复合育种方法

权利要求书

1.一种获得耐盐大麦加倍单倍体的复合育种方法，包括以下步骤：

1)物理诱变及种植

选取大小均匀、籽粒饱满的大麦干种子，用⁶⁰Co γ-射线辐照，辐射剂量率为1Gy·min^-1，剂量为300-500Gy；

将辐照后的干种子进行催芽，发芽后挑选整齐一致的幼苗进行土培移苗，待诱变种子的幼苗生长至开花早期，取小孢子发育处于单核靠边期的小穗，4℃-5℃低温处理2-4周，收集小孢子；

2)小孢子培养

将步骤1)中收集到的小孢子用预处理液于室温、黑暗预处理36-60小时，经预处理后用麦芽糖进行纯化，加入诱导培养基，将小孢子密度调节至1.0-1.5×10⁵个/ml，22-25℃暗培养14-21天，获得愈伤组织；

3)再生培养

把愈伤组织转到分化培养基中，置于23-25℃，光照培养18-20天；待绿苗分化后移入壮苗生根培养基中，获得纯合加倍单倍体无菌苗，无菌苗芽长根长超过2cm时，炼苗3-4周，获得小孢子再生植株；

加代种植获得的小孢子再生植株，成熟后按照单株收获加倍单倍体植株种子，种植条件：温度18-22℃，光照500-1000μmolm² s^-1，湿度60-75％；

4)人工气候室筛选

对步骤3)中收获的加倍单倍体植株种子，消毒后浸泡、催芽，选取露白一致的种子，出芽4-5天后进行水培，首先用自来水培养1天，然后采用氮含量减半的Hoagland营养液培养，待一叶一心期加入盐处理，向氮含量减半的Hoagland营养液营养液中加入浓度为300-480mM的NaCl溶液进行盐胁迫；

培养28天后，利用人工气候室恒温恒湿的可控环境以苗期干物重和鲜物重为筛选指标进行耐盐材料的筛选，选出干物重和鲜物重显著优于原始品种的材料；

其中，人工气候室的光照强度为500-1000μmol m^-2s^-1，温度为18-20℃，湿度为60-75％。

5)大田筛选

对步骤4)筛选出的材料，收获其种子后先进行繁种和去杂，然后按单株种植进行大田种植，在150-300mM/L盐胁迫处理下，以成熟期的单株产量为筛选指标进行耐盐材料的筛选，筛选出统计学意义上显著超出双亲单株产量的植株并收获其种子。

2.根据权利要求1所述获得耐盐大麦加倍单倍体的复合育种方法，其特征在于，步骤2)中，所述预处理液包含：4-6％甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl₂和0.5-1g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸；所述诱导培养基以改良的N₆培养基为基本培养基，其中加有KT 0.4-0.6mg/L和2,4-D0.8-1.2mg/L，麦芽糖80-100g/L。

3.根据权利要求1所述获得耐盐大麦加倍单倍体的复合育种方法，其特征在于，步骤3)中的分化培养基以2/3MS为基本培养基，含6-BA 0.4-0.6mg/L、KT 1.0-2.0mg/L、NAA 0-0.1mg/L和麦芽糖30g/L，用6g/L琼脂粉固化，pH为5.8。

4.根据权利要求1所述获得耐盐大麦加倍单倍体的复合育种方法，其特征在于，步骤3)中的壮苗培养基以1/2MS为基本培养基，其中加有NAA 0-0.1mg/L、蔗糖20-40g/L，3.0-5.0mg/L多效唑，用5-7g/L琼脂粉固化培养基，pH为5.8。

5.根据权利要求1所述获得耐盐大麦加倍单倍体的复合育种方法，其特征在于，步骤3)中的炼苗在氮含量减半的Hoagland营养液中进行。