[发明专利]一种熊去氧胆酸的制备方法

说明书

本发明涉及一种熊去氧胆酸的制备方法，通过将7α‑羟基类固醇脱氢酶(7α‑HSDH)、7β‑羟基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)四个酶构建在同一个共表达质粒pRSFDuet‑1上，四个酶在表达宿主BL21(DE3)中过表达，将鹅去氧胆酸直接在发酵培养基中转化为熊去氧胆酸，且达到了99％以上的转化率，该方法快速、温和、经济、绿色，经过纯化能够得到＞99.8％高纯度的熊去氧胆酸精品，适用于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种新构建的大肠杆菌(Escherichia coli)及其用于制备熊去氧胆酸的全细胞催化方法，属于应用微生物工程技术领域。

背景技术

熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)作为我国名贵中药熊胆的主要有效成分，在临床上广泛用于治疗各种肝胆疾病，包括胆结石、病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化等。至今为止，熊去氧胆酸是唯一由美国FDA批准的可用于治疗原发性胆汁性肝硬化的药物。

目前UDCA的制备方法有三种。首先，最传统的方式是从熊胆汁中提取，即采用引流技术从活熊身上取得熊胆汁后，经过提取和分离纯化等步骤得到，由于熊胆是一种非常稀有的资源，必须依赖人工养殖活熊，这种周期过长、收率低、不人道的传统方式已经被其他方法淘汰；其次是化学合成制备UDCA，以来源于牛、猪、鸡、鸭等动物胆汁中的胆酸(Cholicacid，CA)、猪去氧胆酸(Hyodeoxycholic acid，HDCA)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholicacid，CDCA)为原料合成得到，该方法广泛用于工业生产，但是化学法合成UDCA往往过程复杂，污染大，并且涉及高温高压等危险步骤，显然这种方法已经不适合我国高质量绿色发展的方向；最后，经过最近几十年的研究，人们发现以CDCA为原料，酶法制备UDCA，利用生物酶的选择性催化特性，使得底物的特定位点产生化学反应的性质，完成氧化和还原两步反应，生成熊去氧胆酸，不仅工艺简单、反应条件温和，而且效率高、杂质少。

而现在常用的酶法转化方法，通常需要(1)通过发酵生产制备多个酶，并进行细胞破碎以及分离得到用于生产的粗酶液；(2)在反应体系加入昂贵的辅酶；(3)加入少量的有机溶剂作为助溶剂；(4)多步反应等方式才能得到高转化率的产品。充分利用大肠杆菌的自身的特点，将多个生物酶构建在同一个表达宿主，成为直接转化底物的大肠杆菌“”，同时工程菌胞内含有大量可供反应的辅酶，不仅简化了繁琐的制酶和多步反应过程，同时又减少了辅酶的用量，极大地减少了生产成本。

2017年，上海中医药大学的赵淑娟研究团队，利用合成生物学手段将多个7α和7β进行组合表达构建大肠杆菌工程菌进行全细胞催化，最高的UDCA转化率也仅有50％左右，且底物浓度也只有3g/L，这完全无法达到工业化生产的要求。

本发明通过引入两个辅酶再生体系，且分别是两组不同的辅酶，通过外源性添加反应底物鹅去氧胆酸、丙酮酸钠和葡萄糖，最终可以实现99％以上的转化率。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、温和、经济、绿色的制备熊去氧胆酸的全细胞催化方法，仅仅利用底物鹅去氧胆酸、丙酮酸钠和葡萄糖，通过大肠杆菌生物转化就能得到＞99％高转化率的熊去氧胆酸。

将7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)、7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)四个酶构建在同一个共表达质粒pRSFDuet-1上，转化BL21(DE3)表达宿主，构建好的工程菌成为一个大肠杆菌“”，直接发酵转化底物鹅去氧胆酸，生成熊去氧胆酸。

四个酶共表达质粒(pRSF-GDH-7β-LDH-7α)的构建，首先分别构建2个双酶共表达质粒pRSF-LDH-7α和pRSF-GDH-7β，再通过重叠延伸PCR将LDH-7α和GDH-7β两个基因片段拼接在一起，新的基因片段GDH-7β-LDH-7α通过酶切连接的方式连接到共表达质粒pRSFDuet-1上。