[发明专利]一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株，其特征在于，在鞘氨醇单胞菌菌株NXdP的基础上，将Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的关键活性位点进行突变获得；

所述关键活性位点包括以下一个或多个区域：WalkerA区域、WalkerA'区域、WalkerB区域和C端Tyr簇。

2.根据权利要求1所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株，其特征在于，WalkerA区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

WalkerA'区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

WalkerB区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

C端Tyr簇的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根据权利要求1所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株，其特征在于，Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株，其特征在于，所述突变包括以下一种或几种：点突变、碱基缺失和插入突变。

5.根据权利要求1～4任意一项所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株，其特征在于，WalkerA区域发生点突变的菌株为T4，保藏编号为CGMCC No.22948。

6.一种权利要求1～5任意一项所述具有高效合成Wzy型胞外多糖特性的鞘氨醇单胞菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取鞘氨醇单胞菌菌株NXdP的基因组DNA，使用引物对Csu/Cxl对Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域进行PCR扩增，得到PCR产物；

2)将所述PCR产物克隆至质粒中，得到重组载体；

3)针对Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域的关键活性位点设计突变用引物，以所述重组载体为模板，以所述突变用引物进行PCR扩增，得到的突变的重组载体转化原核生物表达系统中，得到的重组菌1；

4)采用同源重组方法构建Wzy聚合酶的C端酪氨酸激酶区域基因敲除载体；

5)将所述敲除载体转化原核生物表达系统中，得到的重组菌2和菌株NXdP混合进行接合转移，获得缺失Wzy蛋白C端酪氨酸激酶区域的工程菌株NXdP(ΔwzyC)；

6)将步骤3)中的重组菌1和缺失Wzy蛋白C端酪氨酸激酶区域的工程菌株NXdP(ΔwzyC)混合进行接合转移，获得鞘氨醇单胞菌株；

步骤1)～3)和步骤4)～5)之间没有时间顺序的限制。

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，引物Csu的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；引物Cxl的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

8.权利要求1～5任意一项所述鞘氨醇单胞菌株在发酵生产微生物多糖中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述发酵包括好氧发酵和微氧发酵；

所述微氧发酵包括浅盘发酵和/深层静置发酵。

10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述微生物多糖的质构特性如下：弹性值为0.9～1.1，内聚性值为0.7～0.88，回复性值为0.35～0.67；

所述微生物多糖溶液的转变温度包括凝胶温度和溶胶温度；

所述凝胶温度为38～45.0℃；

所述溶胶温度为34～40℃。