[发明专利]一种一锅法合成基因编码β-内酰胺化合物库的方法

说明书

本发明提供了一种由寡聚核酸‑末端炔烃化合物通过衣笠反应(Kinugasa reaction)构建基因编码β‑内酰胺化合物库的方法。该方法普适性好、操作简单、条件温和，能高效率地实现基因编码β‑内酰胺化合物库的构建，为丰富基因编码β‑内酰胺化合物库分子的多样性提供了一条快捷实用的有效途径。该方法适用于多孔板进行的基因编码化合物库的合成。

技术领域

本发明属于基因编码化合物库技术领域，具体涉及将“一锅法”合成寡聚核酸-β-内酰胺的合成策略应用于基因编码化合物库构建的方法。

背景技术

药物研发依赖于多种生物筛选方法来发现先导化合物^[1]。阿斯利康的科学家对2016～2017年间的66个临床候选药物的起源分析发现：43％的临床候选药物是基于已知活性的化合物、内源性配体或以前项目的研究基础发现的。29％是通过高通量筛选方法发现的^[2]。高通量筛选方法是发现先导化合物的重要方法，特别是对未知标靶蛋白配体的发现。剩下的筛选方法包括基于结构的药物设计^[3](Structure-based drug design，简称SBDD；14％)、针对性的筛选(Focused Screening；8％)、基于片段化合物而进行的先导化合物的发现(FBLG；5％)^[4]以及基因编码库筛选(DELT；1％)。SBDD是根据目标蛋白质的3D结构特征，依赖于计算机算法指导小分子化合物结构设计与筛选，是发现先导化合物的一个重要途经^[5-6]。在新型药物的研发过程中，科学家们不断地寻求更多有效的筛选方法，以便在众多化合物中，以无差异性的筛选方式，通过对生物学靶标的结合亲和力和/或药理学效力差异找到优异的活性化合物。高度自动化以及深度优化后的多种高通量筛选法在活性化合物的发现中的重要作用是无可争议的。但是，其高成本、较少的收录化合物总数、有限的化学空间结构以及生物筛选方法上的局限性越来越不能满足新药研发的需求^[7]。在很多疾病蛋白的筛选实践中，用这种传统方法是徒劳无功的。为了能突破高通量筛选方法的瓶颈，使筛选的化合物在数量及化学空间结构上呈现几何级数上的飞跃，以及同时使用多种生物筛选模式，基因编码化合物库技术(DELT)应运而生^[8]。

Brenner和Lerner于1992年提出DELT原创理论，并预见了它能够使用比传统化学更快捷的方式来合成和筛选数量庞大的编码化合物库^[9]。与传统高通量筛选相比，基因编码化合物库(DEL)极大地增加了化合物的数量和化学空间结构的多样性^[10]。在很小的体积例如几十微升的反应管中，通过一系列反应，可以合成上千万甚至上亿种不同的化合物^[11]。DELT的原理是用不同特定序列的基因片段来标记反应过程中的每一个小分子化合物。用组合化学的策略，通过使用拆分、合并(split and pool)的方法，利用有限的成本和时间，大量合成百万级至百亿级连接有特定基因序列标记过的化合物文库^[12]。然后将所得化合物的混合物与蛋白质靶标一起孵育，再通过洗去没有与靶标蛋白质结合的化合物而达到物理分离并找到具有高亲和力的化合物^[13]。孵育靶标蛋白质所需的基因编码化合物库只需极小的剂量(微克)，而且可以在很短时间内(比如1天内)进行。可以轻松地在不同条件下^[14](例如，溶液的酸碱度、样品蛋白混合方式、不同的蛋白质浓度、存在或不存在竞争化合物、存在不同的缓冲液或辅助因子等等)同时进行多项生物筛选实验。由于基因序列与化合物结构一一对应，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)扩增和下一代测序(Next Generation Sequencing，简称NGS)读取后，就可以通过基因序列解码得到活性化合物的化学结构式。进而对具有高亲和力化合物进行“脱离寡聚核酸”的单独合成，并逐个测定没有附着寡聚核酸的化合物与目标蛋白质的结合力以确认其生物活性^[15]。这种生物筛选方式与传统的高通量生物活性筛选中标靶蛋白与单个化合物逐一地进行是根本不同的。