[发明专利]一种外周血T细胞的培养方法

权利要求书

1.一种外周血T细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采集外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞；

（2）向培养瓶中加入含二丁酰环磷酸腺苷、人CD3单克隆抗体的生理盐水作为包被液，在37℃，5%CO₂条件下包被过夜，弃去包被液，作为诱导培养瓶备用；

（3）将步骤（1）的外周血单个核细胞采用诱导培养基重悬，在步骤（2）的培养瓶中培养2-3天，完成诱导培养，所述诱导培养基由基础培养基和添加在基础培养基中的螺旋藻多糖、尿囊素、丙酮酸钠、IFN-γ、白介素-2、白介素-12组成；

（4）向培养瓶中添加含环吡酮、人CD3单克隆抗体的生理盐水作为包被液，在37℃，5%CO₂条件下包被过夜，弃去培养液，作为增殖培养瓶备用；

（5）将步骤（3）完成诱导培养的细胞加入步骤（4）的培养瓶中，采用增殖培养基培养，连续培养12天，即完成，所述增殖培养基的组成为：基础培养基，添加在基础培养基中的以下成分：枸橼酸铋钾、甲壳素、柚皮苷、白介素-2、转化生长因子-α。

2.根据权利要求1所述外周血T细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中生理盐水中二丁酰环磷酸腺苷、人CD3单克隆抗体的浓度为：二丁酰环磷酸腺苷1.5-2μg/mL，人CD3单克隆抗体0.5-1μg/mL。

3.根据权利要求1所述外周血T细胞的培养方法，其特征在于，步骤（3）中诱导培养基的基础培养基为X-VIVO培养基，各成分在培养基中的浓度为螺旋藻多糖10-15ng/mL、尿囊素5-10ng/mL、丙酮酸钠3-5 ng/mL、IFN-γ 20-25 ng/mL、白介素-2 30-35 ng/mL、白介素-1210-15 ng/mL。

4.根据权利要求3所述外周血T细胞的培养方法，其特征在于，各成分在培养基中的浓度为螺旋藻多糖12ng/mL、尿囊素8ng/mL、丙酮酸钠4ng/mL、IFN-γ 22 ng/mL、白介素-2 31ng/mL、白介素-12 13 ng/mL。

5.根据权利要求1所述外周血T细胞的培养方法，其特征在于，步骤（3）生理盐水中环吡酮、人CD3单克隆抗体的浓度为：二丁酰环磷酸腺苷3.5-6.5ng/mL，人CD3单克隆抗体3-5μg/mL。

6. 根据权利要求1所述外周血T细胞的培养方法，其特征在于，步骤（5）中增殖培养基的基础培养基为X-VIVO培养基，各成分在培养基中的浓度为：枸橼酸铋钾1-5ng/mL、甲壳素8-12ng/mL、柚皮苷5-10ng/mL、白介素-2 20-30 ng/mL、转化生长因子-α 10-20 ng/mL。

7. 根据权利要求6所述外周血T细胞的培养方法，其特征在于，各成分培养基中的浓度为：枸橼酸铋钾3ng/mL、甲壳素10ng/mL、柚皮苷8ng/mL、白介素-2 25 ng/mL、转化生长因子-α 15 ng/mL。

8.根据权利要求1所述外周血T细胞的培养方法，其特征在于，步骤（5）在培养过程中每2-3天换液一次。