[发明专利]杀虫基因cry2Ah-vp和cry9Ee组合在抗虫植物中的应用

说明书

本发明为“杀虫基因cry2Ah‑vp和cry9Ee组合在抗虫植物中的应用”。本发明对鳞翅目害虫高毒力的cry2Ah‑vp和cry9Ee基因的改造并合成新的DNA序列，利用农杆菌介导法将两个基因分别转入玉米中，筛选得到高抗黏虫和玉米螟的2HVB5和9EG1转化事件。通过基因聚合方法将cry2Ah‑vp和cry9Ee基因进行组合，获得2HVB5/9EG1转基因玉米材料。实验结果表明cry2Ah‑vp和cry9Ee基因组合的转基因玉米对黏虫、玉米螟，尤其是抗性玉米螟具有高杀虫活性。本发明对于利用cry2Ah‑vp和cry9Ee基因转化植物协同表达培育抗虫植物、害虫防治及抗性治理具有非常重要的意义。

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，特别是涉及杀虫基因cry2Ah-vp和cry9Ee组合在抗虫植物中的应用。

背景技术

虫害是世界农作物减产的一个重要因素，平均每年因此损失粮食总产量的10％左右，直接经济损失高达数千亿美元。过去几十年的防治主要依赖化学农药，在为农业生产做出巨大贡献的同时，化学农药却造成了环境污染、人畜中毒、生态失衡等严重后果。转基因技术的发展和应用为农作物抗虫提供了安全有效的新方法。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽胞的同时，能产生蛋白性质的伴胞晶体(parasporal crystal)，对多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf E.et al,1998,Microbiology and Molecular Biology Review,62(3):775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)又称δ-内毒素(Delta-endotoxin)，在昆虫中肠首先溶解，成为原毒素，之后被肠道蛋白酶降解为具有专一活性的毒素，与中肠上特异的受体进行结合(Craig,2007,Microbiology and Molecular Biology Review,71(2):255–281)，导致昆虫死亡。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、对人畜无害，不污染环境，因而在害虫的生物防治中得到了广泛应用。

自1996年转基因作物商业化以来，转基因作物的应用增长迅速，2019年全球29个国家种植了1.904亿公顷的转基因作物，转基因作物种植面积比1996年增加了约112倍(ISAAA Briefs，2019)。但目前商业化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，主要为cry1A类。长时间大面积推广种植存在害虫避难所减少及害虫抗药性上升的风险。因此需要使用新的高毒力杀虫基因或新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。

cry2Ah基因是从土壤样本中混合收集免培养获得，Cry2Ah蛋白对玉米螟有体重抑制活性，对棉铃虫有生长抑制活性，同时对Cry1Ac抗性棉铃虫也有很好的生长抑制活性(Shu C L,Zhang J T,Chen Gui H,Liang G M,He K L,Crickmore N,Huang D F,Zhang J,Song F P.2013,Journal of Invertebrate Pathology,114:31-33)。将Cry2Ah的第354位缬氨酸后面插入一个脯氨酸得到突变体Cry2Ah-vp。将cry2Ah和cry2Ah-vp基因分别转入烟草植株后，进行了棉铃虫和cry1Ac抗性棉铃虫杀虫活性的试验，结果表明Cry2Ah-vp与Cry2Ah相比具有更高的杀虫活性(Li S Y,Wang Z Y,Zhou Y Y,Li C H,Wang G P,Wang H,Zhang J,Liang G M,Lang Z H.2018,Scientific Reports,8(1):508)。本申请人在专利“人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用”(专利号：ZL201710145166.6)和专利“cry2Ah-vp基因在抗黏虫中的应用”(专利号：ZL201910191397.X)中将cry2Ah-vp基因序列、载体及其应用进行了详细的说明。