[发明专利]一种细胞外囊泡捕获或细胞外囊泡定量分析或细胞外囊泡内含物定量分析的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于细胞外囊泡的内含物定量分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括磁珠和与磁珠结合的第一探针，所述第一探针修饰有与磁珠结合的基团和胆固醇；所述第一探针的核苷酸序列的长度为5~50nt；所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述试剂盒还包括第二探针；所述第二探针的一端标记有胆固醇；所述第二探针的核苷酸序列的长度大于60nt；所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述细胞外囊泡的内含物包括细胞外囊泡的miRNA、细胞外囊泡的mRNA或细胞外囊泡的表面蛋白；所述试剂盒还包括第三探针；所述第三探针含针对待测蛋白设计的核苷适配体序列；所述第三探针的核苷酸序列的长度大于60nt；

所述第一探针的核苷酸序列与第二探针的核苷酸序列和第三探针的核苷酸序列均不杂交。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一探针的一端标记胆固醇，另一端标记与磁珠结合的基团；所述与磁珠结合的基团包括生物素、氨基、羧基或环氧基。

3.一种基于权利要求1或2所述试剂盒的细胞外囊泡内含物的定量分析方法，其不用于疾病诊断目的，包括以下步骤：

1）检测细胞外囊泡浓度，包括以下步骤：

将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；

将不同浓度的细胞外囊泡溶液和待测细胞外囊泡溶液分别与固定有第一探针的磁珠混合，清洗，得到捕获的细胞外囊泡；

将捕获的细胞外囊泡与第二探针混合，清洗，得到固定有第二探针的细胞外囊泡；将固定有第二探针的细胞外囊泡与双蒸水混合，90~100℃加热5~15min，冷却后置于磁力架上，取上清作为模板，使用针对第二探针的核苷酸序列设计得到的引物进行qPCR扩增，以不同浓度的细胞外囊泡的浓度为横坐标，以qPCR扩增得到的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，根据待测细胞外囊泡的Ct值确定待测细胞外囊泡的浓度；

2）还包括对细胞外囊泡的mRNA进行定量分析，步骤为：将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；

将不同浓度的细胞外囊泡溶液分别与固定有第一探针的磁珠混合，得到捕获的细胞外囊泡；

将捕获的细胞外囊泡与DEPC水混合，90~100℃加热5~15min，冷却后置于磁力架上，取上清作为模板，利用针对待测mRNA设计的引物对进行RT-qPCR扩增，以细胞外囊泡的浓度作为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，得到细胞外囊泡浓度与Ct值的关系，Ct值代表细胞外囊泡内mRNA的含量。

4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡内含物的定量分析方法，其特征在于，还包括对细胞外囊泡的miRNA进行定量分析：

将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；

将细胞外囊泡溶液与固定有第一探针的磁珠混合，得到捕获的细胞外囊泡；

将捕获的细胞外囊泡与DEPC水混合，90~100℃加热5~15min，冷却后置于磁力架上，取上清进行逆转录，得到cDNA，以cDNA为模板，利用待测miRNA的引物，使用内参或外参，通过qPCR检测miRNA的表达水平。

5.根据权利要求3所述的细胞外囊泡内含物的定量分析方法，其特征在于，还包括对细胞外囊泡的表面蛋白进行定量分析：将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；

将不同浓度的细胞外囊泡溶液分别与固定有第一探针的磁珠混合，得到捕获的细胞外囊泡；

将捕获的细胞外囊泡与第三探针混合，得到固定有第三探针的细胞外囊泡，将固定有第三探针的细胞外囊泡与双蒸水混合，90~100℃加热5~15min，冷却后置于磁力架上，取上清作为模板，利用针对第三探针设计的引物进行qPCR扩增，以细胞外囊泡的浓度为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，得到细胞外囊泡浓度与Ct值的关系，Ct值代表细胞外囊泡的表面蛋白的含量。