[发明专利]一种检测胰岛素的电化学适配体传感器及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种检测胰岛素的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)AuNPs-Apt探针的制备：将HAuCl₄水溶液在搅拌下加热至沸腾，然后加入柠檬酸钠溶液，回流煮沸，将所得AuNPs溶液冷却至室温，然后再加入Apt溶液，低温孵育，得到AuNPs-Apt探针溶液；

(2)AuNPs修饰电极的制备：将电极依次进行抛光，打磨，清洗并干燥后，用HAuCl₄水溶液通过it法制备电极/AuNPs；

(3)电化学适配体传感器的制备：将Apt溶液滴在电极/AuNPs上，用封闭液孵育，得到电极/AuNPs-Apt。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中Apt的序列为5’-SH-GGT GGT GGG GGG GGT TGG TAG GGT GTC TTC-3’，HAuCl₄水溶液的质量体积比浓度为0.01％-0.02％，柠檬酸钠溶液的质量体积比浓度为2％-8％，HAuCl₄水溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为(50-100)：1，煮沸时间为15-20min，AuNPs溶液与Apt溶液的体积比为(1-2)：19，其中Apt溶液的浓度为50-100μM，孵育温度为2-8℃，孵育时间为16-24h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中电极为激光打印石墨烯电极或玻碳电极，抛光粉为Al₂O₃抛光粉，Al₂O₃抛光粉粒径为0.3、0.05μm，HAuCl₄水溶液浓度为35-45mM，it法的电位为-0.18--0.22V，时间为160-200s。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中Apt溶液浓度为4-6μM，电极为激光打印石墨烯电极或玻碳电极，激光打印石墨烯电极封闭液为牛血清白蛋白溶液，玻碳电极封闭液为巯基己醇溶液，其中牛血清白蛋白溶液的质量体积比浓度为1％-2％，巯基己醇溶液的浓度为8-10mM。

5.权利要求1所述的方法制备的检测胰岛素的电化学适配体传感器，其特征在于：包括用于特异性识别胰岛素的适配体Apt、水解电极表面未与胰岛素结合的多余Apt的核酸外切酶Ⅰ、金纳米颗粒标记的探针溶液AuNPs-Apt、AuNPs修饰的电极；其中Apt通过Au-S键修饰在电极/AuNPs表面,经封闭液封闭非特异性活性位点后，形成电极/AuNPs-Apt。

6.权利要求5所述的检测胰岛素的电化学适配体传感器的使用方法，其特征在于，步骤如下：

a.将电极/AuNPs-Apt传感器先后浸泡于胰岛素的标准溶液、核酸外切酶Ⅰ溶液和AuNPs-Apt探针溶液中孵育，经冲洗后得到电极/AuNPs-Apt/insulin/AuNPs-Apt电化学适配体传感器。

b.将电极/AuNPs-Apt/insulin/AuNPs-Apt电化学适配体传感器浸泡在含有亚甲基蓝溶液的Tris-HCl缓冲溶液中，调节pH后，清洗并作为工作电极，在Tris-HCl缓冲溶液中进行电化学DPV检测，根据所得的峰电流大小与胰岛素的标准溶液之间的关系，绘制工作曲线；

c.检测原待测样品的浓度，然后向其中添加胰岛素，按照a、b操作进行检测，将检测出来的电流信号带入步骤b得到的工作曲线，得到待测样本中胰岛素的浓度。

7.根据权利要求6所述的检测胰岛素的电化学适配体传感器的使用方法，其特征在于：所述步骤a中电极为激光打印石墨烯电极或玻碳电极，激光打印石墨烯电极/AuNPs-Apt浸泡在一系列浓度为0.05pM-1μM的胰岛素的标准溶液中，玻碳电极/AuNPs-Apt浸泡在一系列浓度为0.02pM-5.0μM的胰岛素的标准溶液中，胰岛素溶液中孵育时间为40-60min，核酸外切酶Ⅰ溶液的浓度为1.25-1.50U/μL，孵育温度为36-38℃，孵育时间为2.5-3.0h，探针溶液中孵育时间为15-25min。

8.权利要求6所述的检测胰岛素的电化学适配体传感器的使用方法，其特征在于：所述步骤b中亚甲基蓝溶液的浓度为30-50μM，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.95-0.15M，Tris-HCl缓冲溶液pH值为7.3-7.5，浸泡时间为10-20min。