[发明专利]木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮调控基因TaVel1及其应用

权利要求书

1.一种提高木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮产量的方法，其特征在于，在深绿木霉菌中敲除Tavel1基因，筛选验证，获得6-戊基-2H-吡喃-2-酮高产突变株。

2.根据权利要求1所述的提高木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮产量的方法，其特征在于，所述敲除Tavel1基因包括：构建用于敲除负调控蛋白基因Tavel1的同源重组质粒；将所述重组质粒转化大肠杆菌感受态，验证、筛选阳性克隆；提取重组质粒、转化根癌农杆菌。

3.根据权利要求2所述的提高木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮产量的方法，其特征在于，构建同源重组质粒包括：以提取的深绿木霉基因组DNA为模板，PCR扩增，获得Tavel1基因的上、下游侧翼序列；将上、下游侧翼序列分别导入敲除质粒pC1300qh的上、下游，形成重组质粒pC1300qh-Δvell。

4.根据权利要求3所述的提高木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮产量的方法，其特征在于，扩增Tavel1基因上游侧翼序列的引物为pvel1-F和pvel1-R；pvel1-F的序列如GCGTAAGCTTAAATGTGGCTCTGGCTCTA；pvel1-R的序列如GGTCTCTAGAGATGTCGCGTGGATATGTA。

5.根据权利要求3所述的提高木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮产量的方法，其特征在于，扩增Tavel1基因下游侧翼序列的引物为dvel1-F和dvel1-R；dvel1-F的序列如GGTAGGATCCCTCCGATGTATGAGTGAC；dvel1-R的序列如CAGTGAGCTCCATTATCCAGCAGTAGCA。

6.根据权利要求2所述的提高木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮产量的方法，其特征在于，所述敲除Tavel1基因包括如下步骤：

S1、限制性内切酶HindIII和XbaⅠ酶切目的基因上游片段pvel1和pC1300qh质粒，然后进行酶连，构建pvel1::hyg重组片段；将重组质粒pC1300qhvel1-up转化到大肠杆菌感受态中扩增并筛选阳性克隆；

S2、限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ酶切目的基因下游片段dvel1，与含有上游片段的重组质粒pC1300qhvel1-up相连，导入大肠杆菌感受态中扩增和筛选阳性克隆，提取阳性质粒即pC1300qh::pvel1::hyg::dvel1为敲除载体；

S3、阳性克隆菌落进行ATMT转化，通过在含有潮霉素和特美汀抗性的PDA平板上传代若干次后，获得稳定遗传的转化子，PCR验证结果为同源重组有条带的，即为成功敲除vel1基因的转化子。

7.根据权利要求2所述的提高木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮产量的方法，其特征在于，是将重组质粒导入根癌农杆菌AGL1进行ATMT转化；所述转化采用的诱导培养基为含40umol/LMES和200umol/L AS的IM培养基；采用的筛选培养基为含200μg/mL潮霉素和300μg/mL特美汀的CYA培养基。

8.一种深绿木霉Tavel1基因在负调控木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮合成中的用途。

9.一种深绿木霉Tavel1基因敲除株在木霉6-戊基-2H-吡喃-2-酮合成中的用途。

10.一种深绿木霉T23Δvell菌株，其特征在于，所述深绿木霉T23Δvell菌株为深绿木霉(Trichoderma atroviride)CGMCC NO.23292。