[发明专利]一种人胚胎干细胞体外诱导分化形成的皮肤类器官及其高效培养方法与用途

说明书

本发明公开了一种由人胚胎干细胞体外诱导分化形成的皮肤类器官及其高效培养方法与用途，过程包括：分化前处理；采用第一分化培养基诱导人胚胎干细胞分化形成表皮外胚层和脑神经嵴外胚层细胞；先后采用第二分化培养基、E6培养基诱导步骤一获得的脑神经嵴外胚层细胞分化成真皮成纤维细胞；先后采用第三分化培养基、第四分化培养基先后诱导步骤二获得的培养物的感觉神经末梢及毛囊的发育和成熟。本发明的优点有：提高了从人胚胎干细胞三维分化成皮肤类器官的效率，皮肤类器官获得率为55.30％±11.06％，节约培养成本；获得的皮肤类器官具有分层的表皮、真皮、毛囊、黑素细胞和感觉神经末梢等，可用于感染性、遗传性皮肤病和皮肤肿瘤等疾病研究，为脱发患者植发提供毛发来源。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学及再生医学，具体涉及体外诱导分化获得皮肤类器官的技术。

背景技术

人胚胎干细胞(Human embryonic stem cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在体外或体内环境，hESCs细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。

类器官(Organoid)是一种通过3D培养体外制备类似于机体器官的新技术，2017年被评为《自然》(Nature)杂志的年度技术。类器官的结构和功能均与机体器官高度相似，且遗传信息的可编辑性使得其能在人类遗传性疾病模型研究中发挥重要作用。类器官是将一种或多种衍生细胞在体外进行3D培养可以自组织形成类似于器官的结构，这种衍生细胞主要来源于胚胎干细胞，诱导多潜能干细胞和成体干细胞。与人类疾病动物模型及传统细胞培养相比，3D培养的类器官具有很多优势。类器官的应用范围十分广泛：首先，类器官可以为难以在人体上开展的研究提供重要工具，例如产前发育和组织维持模型；其次，类器官也为研究许多生物学进程提供重要载体，例如，基于类器官研究首次在类器官中观察到了中间神经元的迁移；另外，类器官也可以用于模拟疾病，包括感染性疾病如寨卡病毒感染，单基因遗传性疾病如囊性纤维化，以及肿瘤性疾病等。由于起始干细胞可被编辑携带感兴趣的遗传突变，或者从多个遗传背景衍生，因此这些都可以作为检测基因型对应的表型结果的有力模型。因此，基于类器官制备的疾病模型是人类疾病动物模型的重要补充。

目前，已有的人胚胎干细胞向皮肤类器官分化的方法是Lee J等在2020年报道的(Lee J,Rabbani CC,Gao H,Steinhart MR,Woodruff BM,Pflum ZE,Kim A,Heller S,LiuY,Shipchandler TZ,Koehler KR.Hair-bearing human skin generated entirely frompluripotent stem cells.Nature.2020Jun；582(7812):399-404.doi:10.1038/s41586-020-2352-3.)，该培养方法制备的皮肤类器官获得率为8-28％，效率较为低，难以大规模推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人胚胎干细胞体外诱导分化形成的皮肤类器官及其高效培养方法与用途，以解决现有技术中培养皮肤类器官获得率低的问题。

为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

一种人胚胎干细胞体外诱导分化形成的皮肤类器官的高效培养方法，过程包括：

步骤一：分化前处理；

步骤二：采用第一分化培养基诱导人胚胎干细胞分化形成表皮外胚层和脑神经嵴外胚层细胞；

第一分化培养基的成分包括E6基础培养基、FGF2、BMP4、SB-431542和基质胶；

步骤三：先后采用第二分化培养基、E6培养基诱导步骤二获得的脑神经嵴外胚层细胞分化形成真皮成纤维细胞；

所述第二分化培养基的成分包括E6培养基、FGF2和LDN-193189；