[发明专利]一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法

权利要求书

1.一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法包括以下步骤：

步骤一，准备相关病毒的载体；

步骤二，进行目的基因和指示基因的克隆；

步骤三，进行VIGS的重组载体的构建；

步骤四，进行病毒诱导的基因沉默的实验。

2.如权利要求1所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，步骤三中，所述VIGS的重组载体的构建，包括：

指示基因，即PDS基因和目的基因扩增片段与病毒载体的连接，采用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，双酶切后将酶切产物进行DNA纯化，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞；经PCR鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为指示基因-病毒连接的重组载体和病毒-目的基因连接的重组载体。

3.如权利要求2所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，所述PDS基因和AMS基因的克隆，包括：

提取藜麦叶和花序的RNA，反转合成cDNA第一链；根据NCBI中公布的玉米PDS基因序列XM_021864666.1和预测的藜麦AMS基因序列，选择PDS和AMS的VIGS干扰靶标片段长度分别为461bp和498bp；以藜麦叶片的cDNA第一链为板，PCR扩增CqPDS基因片段，分别在上下游引入BamHI和EcoRI酶切位点和保护碱基；用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析，根据PCR产物纯化试剂盒说明回收目的片段，将其与pGEM-T Easy载体连接，测序验证后再分别插入载体pTRV2中，获得重组VIGS载体pTRV2-CqPDS和pTRV2-CqAMS，测序验证正确后备用。

4.如权利要求3所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，所述扩增PDS引物Cq_PDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述扩增AMS引物Cq_AMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述检测PDS引物RT_PDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测AMS引物RT_AMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述内参基因引物Cq_ACT1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

5.如权利要求2所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，所述VIGS的载体构建，包括：

PDS基因和AMS基因扩增片段于pTRV2载体同时采用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，双酶切后将酶切产物进行DNA纯化，用T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；经PCR鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为重组载体pTRV2-CqPDS和pTRV2-CqAMS。

6.如权利要求1所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，步骤四中，所述病毒诱导的基因沉默的实验，包括：

(1)病毒及其重组载体的农杆菌侵染液的制备；

(2)藜麦材料的准备及注射侵染；

(3)qRT-PCR检测目的基因是否沉默。