[发明专利]一种可高效利用甲醇的重组微生物及其应用

说明书

本发明涉及基因工程和生物发酵技术领域，具体公开了一种可高效利用甲醇的重组微生物及其应用。本发明提供了一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，具有升高的甲醇脱氢酶和二羟基丙酮合成酶的表达和/或酶活性和降低的甲醛异化基因frmAB表达量和6‑磷酸果糖激酶的表达和/或酶活性；所述出发菌株为大肠杆菌。具体同时敲除甲醛异化基因frmAB、6‑磷酸果糖激酶基因pfkAB和α‑酮戊二酸脱氢酶基因sucA，抑制3‑磷酸甘油醛脱氢酶基因gapA后可进一步提高甲醇利用率，降低中间体甲醛的积累。

技术领域

本发明涉及基因工程和生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种可高效利用甲醇的重组微生物及其应用。

背景技术

发展绿色生物制造技术是解决能源环境问题、实现“碳中和”目标的有效途径之一，其核心是构建微生物细胞工厂，高效合成大宗及高值化学品，现已在医药、化工、食品等领域有重要应用。但大多数微生物法生产化学品都依赖糖基原料，存在与人争粮、价格竞争等问题。液态甲醇作为一种基础化工原料，可从天然气、页岩气等制备，价格低廉、储存及运输条件简单，作为生物制造原料有巨大潜力。且甲醇平均碳原子还原度高，为醇、酸等有机化合物的合成提供更强还原力。开发基于甲醇的生物制造工业对于环境保护及经济产能都具有重大意义。

目前基于甲醇的生物利用主要集中在改造天然甲基营养菌、在模式生物中引入外源甲醇利用途径两大类。如何使得改造菌能更高效地利用甲醇仍有必要进行进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种可高效利用甲醇的重组微生物。

本发明的技术方案如下：

一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，具有升高的甲醇脱氢酶和二羟基丙酮合成酶的表达和/或酶活性和降低的甲醛异化基因frmAB表达量和6-磷酸果糖激酶的表达和/或酶活性；所述出发菌株为大肠杆菌。

优选，所述升高的甲醇脱氢酶和二羟基丙酮合成酶的表达和/或酶活性，通过过表达mdh基因和DAS基因实现；所述mdh基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述DAS基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

优选，所述降低的甲醛异化基因frmAB表达量和6-磷酸果糖激酶的表达和/或酶活性，通过敲除所述甲醛异化基因frmAB和6-磷酸果糖激酶基因pfkAB实现；所述甲醛异化基因frmAB的核苷酸序列如SEQ ID No：3-4所示，所述6-磷酸果糖激酶基因pfkAB的核苷酸序列如SEQ ID No：5-6所示。

本发明在大肠杆菌中通过组合引入甲醇脱氢酶和二羟基丙酮合成酶基因，实现了甲醇的初步利用。并通过减少甲醛异化途径(敲除甲醛异化基因frmAB)，敲除大肠杆菌底盘原有竞争途径(糖酵解途径中的6-磷酸果糖激酶基因pfkAB)，进一步提高甲醇利用。

本发明中，所述重组微生物进一步具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶的表达和/或酶活性。

优选，所述降低的α-酮戊二酸脱氢酶的表达和/或酶活性，通过敲除α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA实现，所述α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示。

本发明中，所述重组微生物还具有降低的3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达和/或酶活性。

优选，所述降低的3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达和/或酶活性，通过抑制3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gapA实现，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gapA的核苷酸序列如SEQ ID No：8所示。

本发明还通过进一步敲除或弱化大肠杆菌底盘原有竞争途径(敲除三羧酸循环中的α-酮戊二酸脱氢酶基因，抑制3-磷酸甘油醛脱氢酶基因)，进一步提高甲醇利用率。

本发明还提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：

(1)在生物法转化甲醇中的应用；