[发明专利]一种筛选谷氨酰胺转运蛋白抑制剂的方法、采用该方法筛选出的抑制剂及其应用

说明书

本发明涉及一种筛选谷氨酰胺转运蛋白抑制剂的方法，并基于该人源谷氨酰胺转运蛋白抑制剂筛选体系筛选出了一种新的谷氨酰胺转运蛋白抑制剂米安色林，为米安色林拓展了新的应用领域。本发明公开了米安色林的新用途，该化合物有助于临床上针对多种肿瘤预防和治疗药物的开发。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种筛选谷氨酰胺转运蛋白抑制剂的方法、采用该方法筛选出的抑制剂及其应用。

背景技术

肿瘤细胞为了适应增殖和转移过程中的生物合成和氧化还原需求，会重新调整细胞代谢，以满足能量(葡萄糖)、氨基酸、脂肪酸和其他营养物质的需求。研究表明，干扰或阻断某些代谢途径(例如谷氨酰胺代谢)可以有效逆转肿瘤细胞对抗肿瘤疗法的耐药。谷氨酰胺是血浆中最丰富的非必需中性氨基酸，可以由饮食分解获得或者在肌肉、肝脏、脂肪组织、肺和大脑中生成，是许多代谢过程中的关键中间体，包括能量形成、氧化还原稳态、大分子合成和信号传递等。在快速生长或疾病期间，细胞对谷氨酰胺的需求会超过其供应，谷氨酰胺便会从非必需氨基酸变为必需氨基酸，因此肿瘤细胞谷氨酰胺成瘾是一种代谢补偿，间接促进了氧化糖酵解，以便在缺氧不利条件下为肿瘤细胞提供营养和能量。

谷氨酰胺代谢的关键步骤是SLC1A5(ASCT2)介导的细胞摄取：SLC1A5是Na⁺依赖的跨膜转运蛋白，属于SLC转运蛋白超家族，是肿瘤微环境(TME)中肿瘤细胞的代谢弱点之一。研究发现，SLC1A5的抑制或缺失会导致肿瘤细胞内谷氨酰胺含量降低，使其缺乏能源物质，最终导致肿瘤的生长受到抑制。因此，在肿瘤细胞中，阻断或减少谷氨酰胺的摄取，可能达到抑制住肿瘤细胞生长增殖的作用，提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。基于这个假设，将谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5作为潜在新型靶点，探讨通过调控SLC1A5转运功能治疗癌症的可能性。

SLC1A5是特异性谷氨酰胺的转运体，目前已经开发出一些SLC1A5摄取转运谷氨酰胺的抑制剂，而开发新型的基于小分子化合物的SLC1A5抑制剂意义重大，将为肿瘤的治疗提供更多的药物和方法。该转运体抑制剂的设计及筛选可以通过某些表达SLC1A5的肿瘤细胞完成。但这种筛选方法具有特异性差、通量低、成本高的缺点，因此建立一种合理的抑制剂筛选体系意义重大。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种人源SLC1A5稳定转染细胞株，并应用此细胞株建立了一种筛选方法，筛选出了一种新的谷氨酰胺转运蛋白抑制剂。

本发明中，谷氨酰胺转运蛋白抑制剂通过人源SLC1A5稳定转染细胞株进行筛选，该细胞株的构建方法包括以下步骤：将人源化SLC1A5基因插入至HEK293细胞中得到的细胞株，具体的，

(1)将hSLC1A5基因与pcDNA5-TO(Hygromycin/Ampicillin)表达载体组装，构建pcDNA5-TO-hSLC1A5质粒；其中，从基因库获得hSLC1A5基因序列(NM_005628.3)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

(2)将步骤(1)构建的pcDNA5-TO-hSLC1A5质粒转染至HEK293细胞，使用潮霉素B筛选出阳性克隆，并确认细胞株同时稳定表达人源SLC1A5基因及其蛋白，即构建出所述人源SLC1A5稳定转染细胞株。

本发明采用HEK293细胞作为转染细胞，HEK293为人胚胎肾细胞，发明人通过生化特性检查发现HEK293中缺乏大部分的代谢酶、摄取转运体和外排转运体，且HEK293细胞具有培养周期短、背景较低、易于培养等优点，选择该细胞系进行筛选体系的构建，经过与其他多种转染细胞株的对比，验证HEK293细胞为最优选择。

进一步地，在步骤(1)中，构建重组质粒时的酶切位点为NotI和XbaI。