[发明专利]一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在铜绿假单胞菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP‑1～MNP‑17的标记位点；所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.34所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定铜绿假单胞菌并精细的区分不同的菌株；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析；所述试剂盒对铜绿假单胞菌具有高通量、多靶点、高灵敏、高准确和监测变异的检测优势，可应用于大规模样本的检测，对铜绿假单胞菌的科研和防疫监测均具有重要意义。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas_aeruginosa)原称绿脓杆菌。广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。铜绿假单胞菌可感染人体的任何组织和部位，经常引起手术切口、烧伤组织感染，表现为局部化脓性炎症。也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、脓胸等。另外可引起菌血症、败血症以及婴儿严重的流行性腹泻。近年来，由于免疫抑制剂、光谱抗生素的广泛使用，铜绿假单胞菌感染呈现增多趋势；并且，随着耐药菌株的流行，此菌感染后会导致较高的死亡率。因此，快速、准确的铜绿假单胞菌的检测对于早期诊断及控制具有重要意义。

另外，铜绿假单胞菌也是实验室进行研究常用的模式病原微生物。其作为群体生物，在和宿主、环境的互作中，群体内个体会发生变异。对于实验室的研究来说，这种不易被察觉的变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的菌株实际上并不相同，导致实验结果的不可重现和不可比较。人Hella细胞实验室间的异质性已经导致大量的实验结果的不可比较和数据浪费。因此，开发高效、准确、灵敏和可监测变异的铜绿假单胞菌检测分析方法对于铜绿假单胞菌的科学研究和应用都具有重要意义。

经典的铜绿假单胞菌检测方法，包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序等，在时长、操作复杂度、依赖于病原菌分离培养、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组技术需要的繁琐的病原菌的分离培养步骤和宏基因组测序技术带来的大量数据浪费和背景噪音，具有样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异和免培养的优势。现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的多等位基因型。

因此，开发铜绿假单胞菌的高多态性的新型分子标记及其高效、准确、灵敏、不依赖于培养的检测技术，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对铜绿假单胞菌进行鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏、高准确和免培养的效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点，所述MNP标记位点是指在铜绿假单胞菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括铜绿假单胞菌参考序列上MNP-1～MNP-17的标记位点。

上述技术方案中，MNP-1～MNP-17的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括17对引物，具体的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.34所示。