[发明专利]3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaA2B2及其应用

说明书

本发明公开了一种3‑溴‑4‑羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaA2B2及其应用。本发明提供了3‑溴‑4‑羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaA2B2(SEQ ID NO.1)。利用该基因簇构建的工程菌株可以快速降解3‑溴‑4‑羟基苯甲酸，表达的单加氧酶PHBH2(SEQ ID NO.3)和双加氧酶PcaA2B2(SEQ ID NO.5和NO.7)可以将3‑溴‑4‑羟基苯甲酸依次转化为3‑溴‑4,5‑二羟基苯甲酸和2‑溴‑4‑羧基‑已二烯二酸。因此，生产的降解菌剂可用于去除土壤和水体中残留的3‑溴‑4‑羟基苯甲酸，表达的PHBH2酶制剂也可用于土壤和水体中3‑溴‑4‑羟基苯甲酸的降解和转化。

技术领域

本发明属于应用环境微生物领域，涉及一种3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaA2B2及其应用。

背景技术

3-溴-4-羟基苯甲酸作为一种重要的化工中间体，广泛应用于工业、农业化学品的合成。此外，3-溴-4-羟基苯甲酸也是很多卤代芳烃(如溴苯腈、辛酰溴苯腈、多溴联苯醚等)降解的中间产物。由于卤素原子的强电子吸附效应，3-溴-4-羟基苯甲酸易对生命细胞产生毒性，对人类健康和生态环境安全具有较大的威胁。此外，3-溴-4-羟基苯甲酸易溶于水，扩散系数高，并易对河流、地下水等造成污染。因此，3-溴-4-羟基苯甲酸的环境污染以及污染环境的修复问题引起了广泛关注。相比于传统的物理和化学修复手段如淋洗、焚烧等，利用微生物修复有机物污染的方法是一种绿色、高效、廉价和无二次污染的方法。代谢途径的多样性使得微生物成为环境中有机污染物降解的主力军。微生物合成的酶在有机污染物的降解、修复过程中起着决定性的作用。提取的降解酶来消除有机污染物残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。从微生物中克隆3-溴-4-羟基苯甲酸的降解基因簇，通过基因工程手段构建高效降解能力的工程菌，也可以构建降解酶的高效表达菌株用于酶制剂的生产。3-溴-4-羟基苯甲酸降解基因簇的获得在3-溴-4-羟基苯甲酸污染的修复领域有着巨大的应用潜力。同时可通过基因改造扩大降解酶的作用底物范围，可广泛应用于环境中卤代对羟基苯甲酸的降解和脱毒，保护环境。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的参与3-溴-4-羟基苯甲酸降解的氧化酶基因簇phbh2pcaA2B2。

本发明的另一目的是提供单加氧酶基因phbh2编码的单加氧酶PHBH2和双加氧酶基因pcaA2B2编码的双加氧酶PcaA2B2。

本发明的又一目的是提供该氧化酶基因簇phbh2pcaA2B2的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

3-溴-4-羟基苯甲酸氧化酶基因簇phbh2pcaA2B2，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，基因簇全场长2376bp，主要由单加氧酶基因phbh2、双加氧酶α亚基基因pcaA2和双加氧酶β亚基基因pcaB2构成。

一种3-溴-4-羟基苯甲酸单加氧酶基因phbh2，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1176bp，G+C含量为69.47％，编码391个氨基酸，分子量为43.2kDa。

本发明所述的3-溴-4-羟基苯甲酸单加氧酶基因phbh2编码的单加氧酶PHBH2，氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

一种双加氧酶基因pcaA2B2，其α亚基基因pcaA2的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为363bp，G+C含量为63.37％，编码120个氨基酸，分子量为13.5kDa；β亚基基因pcaB2的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为840bp，G+C含量为65.95％，编码279个氨基酸，分子量为31.6kDa。