[发明专利]重组T4连接酶突变体、编码DNA及NGS建库方法有效
| 申请号： | 202111336097.X | 申请日： | 2021-11-12 |
| 公开（公告）号： | CN113774032B | 公开（公告）日： | 2022-03-01 |
| 发明（设计）人： | 宋东亮;陈晶晶;江翱;孙睿;侯策;王嫚;刘倩;曹振 | 申请（专利权）人： | 翌圣生物科技（上海）股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/00 | 分类号： | C12N9/00;C12N15/52;C12Q1/6806;C40B50/06 |
| 代理公司： | 苏州根号专利代理事务所(普通合伙) 32276 | 代理人： | 朱华庆 |
| 地址： | 200120 上海市浦*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组 t4 连接酶 突变体 编码 dna ngs 方法 | ||
1.一种重组T4连接酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No . 8所示。
2.根据权利要求1所述的重组T4连接酶突变体，其特征在于在重组T4连接酶突变体的一端或者两端通过多肽桥重组双链DNA结合域。
3.根据权利要求2所述的重组T4连接酶突变体，其特征在于所述双链DNA结合域为p50、cTF、DSBA、H6、HNS或HTH。
4.根据权利要求3所述的重组T4连接酶突变体，其特征在于所述多肽桥为GGGGS多肽、PAPAPAPA多肽、GQGQGQGQ多肽或AAAAA多肽。
5.根据权利要求2所述的重组T4连接酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.15-19、21-24中任一项所示。
6.根据权利要求2所述的重组T4连接酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。
7.权利要求1所述的重组T4连接酶突变体的编码DNA，其特征在于其核酸序列如SEQ IDNo . 32所示。
8.权利要求5所述的重组T4连接酶突变体的编码DNA，其特征在于其核酸序列如SEQ IDNo .33-37、39-42中任一项所示。
9.一种NGS建库方法，其特征在于其步骤包括：
（1）采用平末端双链DNA片段化酶将DNA片段化；
（2）权利要求1-6中任一项所述的重组T4连接酶突变体介导的腺苷酰化接头连接；
（3）磁珠回收DNA；
（4）缺口修复；
（5）文库扩增及回收。
10.根据权利要求9所述的NGS建库方法，其特征在于：步骤（1）中的平末端双链DNA片段化酶为多种酶的混合物，包括热敏感性碱性磷酸酶和T4 DNA聚合酶，还包括脱氧核糖核酸I、创伤弧菌核酸酶、全能核酸酶、微球菌核酸酶中的一种或数种。
11.根据权利要求10所述的NGS建库方法，其特征在于：步骤（1）的DNA片段化反应温度为37℃，反应时间为3-15 min。
12.根据权利要求9所述的NGS建库方法，其特征在于：步骤（2）中采用的接头为接头A和接头B的退火产物，所述接头A的序列为：/App/AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGT/ddC/，接头B的序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-p。
13.根据权利要求12所述的NGS建库方法，其特征在于：步骤（2）中接头反应的反应温度为20℃，反应时间为15 min。
14.根据权利要求9所述的NGS建库方法，其特征在于：步骤（4）中采用T4磷酸激酶和E.coli连接酶进行缺口修复。
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