[发明专利]一种单碱基编辑载体及其构建和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种包含dFnCpf1序列和crRNA序列的单碱基编辑载体及其构建和应用。与现有的采用包含Cas9序列的编辑载体相比，本发明的单碱基编辑载体在目标基因靶位点的5’端识别富含T的PAM[5’‑(T)TTN‑3’]序列，可以在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域进行编辑操作。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种单碱基编辑载体及其构建和应用。

背景技术

传统育种中利用的遗传变异主要来自于自然突变、物理或化学诱变，存在变异概率低、周期长、位点不可控等缺点。成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)系统作为第三代基因编辑技术，由单链引导RNA(single-guide RNA,sgRNA)与切割靶序列的Cas内切核酸酶组成，其主要依赖sgRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂(Double-strand break,DSB)，而DSB可以通过非同源末端连接(non-homologous endjoining,NHEJ)或同源重组(homology recombination,HR)2种方式进行修复，修复过程中会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或者替换，从而实现基因编辑。

为满足不同的编辑目的，研究人员以CRISPR/Cas系统为基础，通过融合表达Cas9突变蛋白、胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶，开发出能够对靶位点进行精准单碱基编辑的系统。该系统在不引起DNA双链断裂的情况下，实现胞嘧啶(cytosine,C)转化胸腺嘧啶(thymine,T)/鸟嘌呤(guanine,G)转化腺嘌呤(adenine,A)的替换且通过不断改进大大提高单碱基编辑效率，减少插入和删除(Insertion and deletion,indel)和非预期突变。该系统已成功在小麦(Triticumaestivum)、水稻(Oryza sativa)、棉花(Gossypium)、玉米(Zea mays)等物种上实现安全高效的单碱基替换编辑。但目前该系统仅利用nCas9蛋白突变体(Cas9 nicknase,nCas9)或dCas9蛋白突变体(deactivated Cas9,dCas9)作为效应蛋白，所识别的PAM序列为鸟嘌呤/胞嘧啶富集区。因此利用现有的碱基编辑系统无法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域进行编辑操作。

发明内容

本发明针对目前亟需一种可以在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域进行编辑操作的系统，提供了一种单碱基编辑载体及其构建和应用。

为此，本发明一方面提供了一种单碱基编辑载体，其包含dFnCpf1序列和crRNA序列。

在本发明优选的实施方案中，所述的单碱基编辑载体为dFnCpf1-CBE-BT2，载体结构如图2B所示。

本发明另一方面提供了包含本发明所述的单碱基编辑载体的宿主细胞。

在本发明优选的实施方案中，所述的宿主细胞为玉米原生质体。

本发明另一方面提供了一种单碱基编辑载体的构建方法，其包括如下步骤：

1、构建包含dFnCpf1序列的载体；

2、合成包含crRNA序列的表达框；

3、构建包含dFnCpf1序列和crRNA序列的单碱基编辑载体。

在本发明优选的实施方案中，所述的单碱基编辑载体的构建方法，其包括如下步骤：

1、以PB-nCas9-PBE载体为骨架，切除nCas9序列，以pUC57-dFnCpf1载体为模板，扩增dFnCpf1序列，将dFnCpf1序列连入线性化的PB-nCas9-PBE载体，构建dFnCpf1-PBE载体，并切除OsU3-sgRNA-scaffold表达框；