[发明专利]一种公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白及其表达和应用

说明书

本发明公开了一种公子小丑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽蛋白及其表达和应用，利用公子小丑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽蛋白构建能够大量表达公子小丑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株，获得的公子小丑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白纯化后能够制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。

技术领域

本发明涉及生物技术制药工业中基因工程领域，特别是一种公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白及其表达和应用。

背景技术

近年来，有关抗生素在医药，食品加工，畜牧渔业等领域中过度使用或误用，导致细菌耐药性和药物残留等问题日益突出，迫切需要寻找新型抗菌药物替代现有抗生素。其中抗菌肽具有高抗菌活性、广抗菌谱和低毒性等优点，使得抗菌肽的研发及应用研究成为国内外医用药物和饲料科学的研究热点。迄今为止，国内外研究报道已有80余种抗菌肽在鱼类中被分离鉴定，其中NK-Lysin是鞘脂激活蛋白样蛋白(saposin-like proteins，SALIP)家族的成员，首次在猪毒性淋巴细胞中发现，研究表明NK-Lysin是由白细胞介素2激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞产生效应蛋白(抗菌肽)，具有广谱抗菌活性。

研究表明NK-Lysin结构非常保守，具有典型的鞘脂激活蛋白B结构域与六个半胱氨酸，而这六个半胱氨酸形成三个分子内二硫键结构，这种结构有利于NK-Lysin附着在细胞膜上形成孔，破坏微生物的脂质双层膜。在卵形鲳鲹(Trachinotus Ovatus)，尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)，大黄鱼(Larimichthys crocea)，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)等研究表明，NK-Lysin对细菌、真菌，病毒和寄生虫等具有抑制作用。

公子小丑鱼(Amphiprion ocellaris)广泛分布于西太平洋印度尼西亚、泰国、菲律宾、新加坡及澳大利亚西北部，常生存在珊瑚礁区域，与海葵伴生，适合水族饲养与观赏。目前在我国南方进行中小规模示范养殖，亩产高达10万尾，每年创造产值50-300万元。然而，随着公子小丑鱼养殖产业兴起，再加上养殖环境日益恶化，公子小丑鱼养殖病害频发，常引起较高死亡率，严重影响公子小丑鱼产业的可持续发展。传统养殖过程中多采用抗生素进行治疗，但长期使用抗生素不但污染养殖环境，同时还会导致病原体产生抗药性。因此，开发一种安全、高效的抗生素替代物尤为重要。

因此，将公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin蛋白作为这一种水产养殖病害预防和治疗药物或添加剂进行开发，将产生很高的经济效益，但采用人工合成或直接从鱼体提取等传统方法生产抗菌肽NK-Lysin蛋白，制作成本较高、工艺复杂且获取量少的缺点，无法满足市场需求，因此提高NK-Lysin蛋白产量是一个急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白及其表达和应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

首先，本发明提供了一种公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白，所述公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

其次，本发明还提供了一种公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的制备方法，以公子小丑鱼组织cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出公子小丑鱼NK-Lysin基因ORF序列，公子小丑鱼NK-Lysin基因ORF序列如SEQ ID NO.1所示；再以公子小丑鱼NK-Lysin基因ORF序列为模板，克隆出公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白序列。

再者，本发明还提供了一种公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株。所述公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株的制备方法，包括以下步骤：