[发明专利]生产NMN的菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种生产NMN的菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建表达以下基因的质粒，所述基因包括：葡萄糖6-磷酸异构酶基因Pgi、烟酰胺磷酸核糖转移酶基因Nampt和PPP途径基因，其中所述PPP途径基因包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因Zwf、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因Pgl、6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因Gnd、核糖-5磷酸异构酶A基因RpiA、核糖-5磷酸异构酶B基因RpiB、磷酸核糖焦磷酸激酶基因Prs；

(2)将质粒转化至大肠杆菌中，筛选基因转化阳性菌株即得；

优选地，所述质粒还表达烟酰胺核糖转运蛋白基因Pnuc；

优选地，所述Pgi、Zwf、Pgl、Gnd、RpiA、RpiB、Prs、Nampt、Pnuc的DNA序列分别如SEQ IDNO.1～9所示；

优选地，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21、BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述Zwf、Pgl、Gnd、RpiA、RpiB、Prs、Pgi、Pnuc、Nampt被构建在多个质粒中。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述质粒包含启动子，所述启动子选自araBAD启动子、lac启动子、lacUV5启动子、tac启动子、trp启动子、trc启动子和T7启动子。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(1)中，构建质粒p33-PiZfRA、p4-PlGdRBPs和p28a-Nt；其中，质粒p33-PiZfRA的起始质粒是pBAD33，启动子是araBAD启动子，含有三种基因Pgi、Zwf和RpiA；质粒p4-PlGdRBPs的起始质粒是pBBR1MCS-4，启动子是T7启动子，含有四种基因Pgl、Gnd、RpiB和Prs；质粒p28a-Nt的起始质粒是pET-28a，启动子是T7启动子，含有一种基因Nampt；或者

步骤(1)中，构建质粒p33-PiZfRA、p4-PlGdRBPs和p28a-NtPs；其中，质粒p33-PiZfRA的起始质粒是pBAD33，启动子是araBAD启动子，含有三种基因Pgi、Zwf和RpiA；质粒p4-PlGdRBPs的起始质粒是pBBR1MCS-4，启动子是T7启动子，含有四种基因Pgl、Gnd、RpiB和Prs；质粒p28a-NtPs的起始质粒是pET-28a，启动子是T7启动子，含有两种基因Nampt、Prs；或者

步骤(1)中，构建质粒p33-PiZfRA、p4-PlGdRBPs和p28a-NtPsPc；其中，质粒p33-PiZfRA的起始质粒是pBAD33，启动子是araBAD启动子，含有三种基因Pgi、Zwf和RpiA；质粒p4-PlGdRBPs的起始质粒是pBBR1MCS-4，启动子是T7启动子，含有四种基因Pgl、Gnd、RpiB和Prs；质粒p28a-NtPsPc的起始质粒是pET-28a，启动子是T7启动子，含有三种基因Nampt、Prs和Pnuc。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，每个质粒中的每种基因均为一个拷贝。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其中，所述方法还包括敲除大肠杆菌中NMN腺苷转移酶基因NadR和NMN氨基水解酶基因PncC；优选地，所述NadR和PncC的DNA序列分别如SEQ ID NO:10和11所示。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法获得的生产NMN的菌株；优选地，所述菌株为NMN-01、NMN-02、NMN-03或NMN-04。

8.一种生产NMN的方法，包括发酵培养权利要求7所述的菌株。