[发明专利]一种基于膜体系-酵母双杂交发现膜蛋白的方法

说明书

本发明涉及膜蛋白实验技术领域，且公开了一种基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，一种基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，包括以下材料诱饵克隆：pBT3‑STE‑A、诱饵载体：pBT3‑STE、文库酵母质粒：草膜文库、Clontech酵母双杂交系统、培养基、贮备液。该基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，通过将诱饵质粒转化受体菌NMY51中及其自激活检测、文库筛选、筛库结果、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果、酵母阳性克隆回转验证等步骤，通过酵母阳性克隆回转验证将筛选得到的34个酵母阳性克隆，均能在SD‑TL、SD‑TLH+30mM 3AT、SD‑TLHA+30mM 3AT缺陷性平板上生长，从而得到最终的膜蛋白，解决了与pBT3‑STE‑A作用的蛋白不易发现的问题。

技术领域

本发明涉及膜蛋白实验技术领域，具体为一种基于膜体系-酵母双杂交发现膜蛋白的方法。

背景技术

生物膜所含的蛋白叫膜蛋白，是生物膜功能的主要承担者。根据蛋白分离的难易及在膜中分布的位置，膜蛋白基本可分为三大类：外在膜蛋白或称外周膜蛋白、内在膜蛋白或称整合膜蛋白和脂锚定蛋白，膜蛋白包括糖蛋白，载体蛋白和酶等。通常在膜蛋白外会连接着一些糖类，这些糖相当于会通过糖本身分子结构变化将信号传到细胞内，研究膜蛋白结构的技术包括X射线衍射、核磁共振波谱、电子显微镜、原子力显微镜、红外光谱和圆二色谱等。其中X射线衍射和核磁共振波谱技术是对膜蛋白三维结构进行研究的主要方法。尤其利用固体核磁共振技术可在接近膜蛋白的天然环境的磷脂双分子层中研究膜蛋白的三维结构信息和动力学特征，随着对于膜蛋白研究的深入，实验中研究发现与pBT3-STE-A作用的蛋白不易发现，影响实验的进行现在提出一种基于膜体系-酵母双杂交发现膜蛋白的方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于膜体系-酵母双杂交发现膜蛋白的方法，具备以构建好的pBT3-STE-A基因为诱饵，筛选酵母双杂交草膜文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pBT3-STE-A相互作用的蛋白的优点，解决了与pBT3-STE-A作用的蛋白不易发现，影响实验进行的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于膜体系-酵母双杂交发现膜蛋白的方法，包括以下材料，

诱饵克隆：pBT3-STE-A；

诱饵载体：pBT3-STE；

文库酵母质粒：草膜文库；

Clontech酵母双杂交系统；

培养基；

贮备液。

优选的，所述培养基包含大肠杆菌培养基、酵母完全培养基与酵母缺陷型筛选培养基，所述大肠杆菌培养基为0.5％Yeast extract，1％ Polypeptone，1％NaCl，所述酵母完全培养基为1％Yeast extract，2％Tryptone， 2％Glucose,0.02％Adenine。

优选的，一种基于膜体系-酵母双杂交发现膜蛋白的方法，操作流程如下：

S100、将诱饵质粒转化受体菌NMY51中及其自激活检测；

S200、文库筛选；

S300、筛库结果；

S400、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果；

S500、酵母阳性克隆回转验证。

优选的，所述将诱饵质粒转化受体菌NMY51中及其自激活检测包含有酵母转化、酵母转化方法、自激活检测，且选用30mM 3AT进行后续筛库浓度。