[发明专利]一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：

（1）将2.5 cm × 0.8 cm的ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；

（2）将8 ~ 12 μL、3 ~ 8 mg/mL CdWO₄-TiO₂悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

（3）将4 ~ 6 μL、CdS量子点溶液滴加至CdWO₄-TiO₂修饰的电极表面，室温下反应20 ~40分钟，超纯水冲洗电极表面；

（4）在修饰电极表面继续滴加3 ~ 5 μL的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（5）滴加3 ~ 5 μL 10 μg/mL的β-乳球蛋白抗体溶液，反应20 ~ 40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（6）继续滴加3 ~ 5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（7）继续滴加3 ~ 5 μL、0.005 ~ 10 ng/mL的β-乳球蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂的β-乳球蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用；

所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺含1 × 10^-2mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和2 × 10^-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺；

所述CdS量子点的制备步骤如下：（1）200 ~ 300 μL 巯基乙酸加入40 ~ 60 mL 0.01mol·L^-1 CdCl₂水溶液中，在40℃下通入N₂鼓泡30分钟以去除水中溶解的氧气；（2）加入1.0mol·L^-1 NaOH水溶液将步骤（1）溶液的pH值调节至11；（3）将4.5 ~ 6.5 mL 0.1 mol·L^-1Na₂S水溶液注入上述溶液（2）中，反应混合物在N₂气氛下回流4小时；（4）用相同体积的去离子水与溶液（3）混合，得到所需的CdS量子点溶液，并储存在4℃的冰箱中以备进一步使用。

2.如权利要求1所述的一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，所述CdWO₄-TiO₂电极的制备，其特征在于，步骤如下：

（1）取1.0 ~ 1.5 mmol Cd(NO₃)₂·4H₂O 和1.0 ~ 1.5 mmol Na₂WO₄·2H₂O分别溶解在12.5 mL去离子水中，分别标记为A和B；在搅拌下将溶液B滴加到溶液A中，持续搅拌30 min后，将混合物转移到50 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，180 ℃下反应24 h；自然冷却至室温后，离心收集产物，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，然后在50 ℃下真空干燥；

（2）将20 ~ 30 mg合成的CdWO₄和25 ~ 35 mg TiF₄与10 mL H₂O放入聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在90 ℃下保持24小时，冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，50 ℃下真空干燥；

（3）将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg/mL CdWO₄-TiO₂悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟，自然冷却至室温，制得CdWO₄-TiO₂电极。

3.如权利要求l所述的一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于β-乳球蛋白的检测，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站的三电极系统进行信号测定，测试溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为6.0 ~ 8.5的0.1 mol/L的抗坏血酸磷酸盐缓冲溶液；

（2）采用i-t法对不同浓度的标品β-乳球蛋白进行检测，设置电压为0 V，运行时间为50s，激发光源为LED，记录电流的变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品稀释之后代替（2）中标准品进行检测，根据光电流响应强度和工作曲线，得到待测样品中β-乳球蛋白的含量。