[发明专利]联合流式细胞分选和拉曼技术对Tetrasphaera亚群胞内代谢物测定的方法

权利要求书

1.联合流式细胞分选和拉曼技术对Tetrasphaera亚群胞内代谢物测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取处理生活污水反应器中的泥样400～600μL，在10000r/min转速下离心3min，弃掉上清液，加入1mL PBS缓冲液涡旋、离心3次，去除上清液，完成污泥的清洗；清洗后加入所取泥样三倍体积的质量百分比浓度为4％的多聚甲醛固定液，在4℃温度下固定2h；将固定好的样品取出，在10000r/min转速下离心3min,去除上清液，再加入1～1.5mL PBS缓冲液清洗两次，离心去除上清液，加入与原泥样相同体积的PBS缓冲液在冰浴下超声，超声功率为75～85w，超声59s，间隔1s，总时长4～5min；将超声好的样品分装多份，每份依次添加体积浓度为50％、80％和99％的乙醇溶液1mL进行脱水，每次脱水3min，晾干；

(2)分装晾干后的第一个离心管中添加300μL杂交缓冲液作为单阳对照，其他离心管中添加267μL杂交缓冲液+33μL探针的杂交混合液作为双阳样本，超声重悬1min，放在46℃恒温培养箱中杂交2h30min～3h；杂交完成后，离心去除上清液，加入1mL杂交清洗液清洗1次，离心去除上清液，加入1mL PBS缓冲液，冰浴中超声重悬1min，过10μm滤膜后于新的离心管中加入10μL SYBR GreenⅠ染料染全菌15min，稀释500～1000倍后上机检测；

(3)打开流式细胞分选仪，流式细胞分选仪配备488nm和633nm激光器,采用488nm发射谱线用于微生物细胞前角光散射FALS和FITC绿色荧光的测定，633nm发射谱线用于红色荧光APC的测定；设置FITC阈值为400～500，进样收集50000个颗粒，圈出发红色荧光的Cy5染料标记的探针所在区域；调试好细胞分选的各参数：鞘压力：31.5～31.9psi，使用70μm尖端；下降频率：88～92kHz；振幅：45.7～46.1V；手动液滴延迟：44～46；中断点：178～182；分选装置的角度设为60～70°，使液流直接进入到收集管底部；将样品放在上样架上，设定收集速率1500～2000events·s^-1，进行100000个颗粒的细胞分选；

(4)分选完毕后分别取出样品管和分选管，将分选管放在上样架上，进样速率调至最高后按照步骤(3)进行分选纯度的测定；

(5)分选管中样品转移到新的离心管中在6000r/min下离心15min用于所获Tetrasphaera各亚群的浓缩，取离心浓缩的样品10μL放在CaF₂窗片上；打开激光共聚焦拉曼光谱仪和WiRE 2.0软件，将硅片放置在载物台上，选取532nm激光器，使其在321cm^-1出现唯一强特征峰完成仪器的校准；对校准后的仪器进行参数设置：所有测量均选择785nm半导体激光器，使用的光栅为600mm/槽，光谱范围选择从300到3000cm^-1；每个细胞照射时间为10s，强度为0.5～5％，测试次数为3次；

(6)参数设置完成后，将含有浓缩样品的CaF₂窗片放在50X长焦显微镜下观察，通过微调看到清晰的细胞后运行拉曼光谱仪获得该细胞的拉曼光谱图，通过与已有标准品的拉曼特征峰对比确定胞内存在的氨基酸、PHA和poly-P。