[发明专利]检测恩镰孢菌素化学发光试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒，包括清洗液，其特征是，还包括以下试剂：1)恩镰孢菌素校准品；2)恩镰孢菌素衍生物磁珠连接物；3)酶结合物；4)化学发光底物。

2.根据权利要求1所述的检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒，其特征是：所述恩镰孢菌素校准品为经过定值的恩镰孢菌素ENNs。

3.根据权利要求1或2所述的检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒，其特征是：恩镰孢菌素校准品为以下至少一种：恩镰孢菌素A(ENA)、恩镰孢菌素A1(ENA1)、恩镰孢菌素B(ENB)、恩镰孢菌素B1(ENB1)。

4.根据权利要求3所述的检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒，其特征是：

磁珠粒径为1μm-5μm；

磁珠修饰基团包含但不限于氨基、羧基、巯基、NHS。

5.根据权利要求4所述的检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒，其特征是：

恩镰孢菌素衍生物为恩镰孢菌素通过化学合成偶联到大分子蛋白上合成；大分子蛋白包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、匙蓝蛋白。

6.根据权利要求5所述的检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒，其特征是：酶结合物的主要成分是碱性磷酸酶标记的恩镰孢菌素单克隆抗体；

恩镰孢菌素单克隆抗体能够识别如下四种恩镰孢菌素：恩镰孢菌素A(ENA)、恩镰孢菌素A1(ENA1)、恩镰孢菌素B(ENB)、恩镰孢菌素B1(ENB1)。

7.根据权利要求6所述的检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒，其特征是：

所述化学发光底物的主要成分是3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐。

8.根据权利要求7所述的检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒，其特征是：

一、恩镰孢菌素的单克隆抗体制备过程如下：

步骤一：恩镰孢菌素免疫原的合成，将恩镰孢菌素与载体蛋白牛血清白蛋白进行共价偶联；

步骤二：动物免疫，将恩镰孢菌素合成抗原BSA-ENNs免疫小鼠，初次免疫后加强两次，共三次免疫；

步骤三：细胞融合及筛选，取抗体效价较高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用选择性培养基进行细胞筛选；用间接ELISA方法检测细胞培养上清；选择能与四种恩镰孢菌素：恩镰孢菌素A(ENA)、恩镰孢菌素A1(ENA1)、恩镰孢菌素B(ENB)、恩镰孢菌素B1(ENB1)都有交叉的抗体细胞株；

步骤四：腹水制备和纯化，选择稳定分泌抗体的细胞株，采用体内诱生腹水方法制备单克隆抗体，利用ProteinA/G柱纯化腹水中的单克隆抗体；

二、校准品的配制，包括以下步骤：

1)校准品缓冲液，缓冲液为pH 7-7.5的10mmol/L的Tris缓冲液，含有万分之1-5的Proclin-300；

2)将恩镰孢菌素纯品溶解，配制成为1ug/ml的储液，随后一次稀释成为2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml，加上0点，共8个校准品梯度；

三、恩联保菌的磁珠连接物的制备，包括以下步骤：

1)取10％的磁珠加入到离心管中，磁性分离去除上清；

2)加入无水乙醇，混合均匀磁性分离去除上清；

3)恩镰孢菌素-卵清蛋白偶联物(ENNs-OVA)用含NaCl的pH5.5-7.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液溶解；MES缓冲液浓度在0.1mol/L-0.3mol/L，MES缓冲液pH优选pH6.0；NaCl浓度为0.1-0.2mol/L；

4)将上述处理过的磁珠加入到上述恩镰孢菌素-卵清蛋白偶联物(ENNs-OVA)溶液中，混合反应，磁性分离去除上清；反应温度在20-25℃，反应时间控制在2-3h；

5)加入封闭液，封闭反应，反应后磁性分离去除上清；封闭液为含有牛血清白蛋白的MES缓冲液；MES缓冲液浓度为0.1mol/L-0.3mol/L，MES缓冲液pH优选pH5.0-6.0；NaCl浓度为0.1-0.2mol/L，BSA浓度为0.1-0.2％；封闭反应温度在20-25℃，反应时间控制在2-3h；

6)加入清洗缓冲液清洗3-5次，磁性分离去除上清；清洗缓冲液为10-100mmol/L的Tris-Cl缓冲液，其中含有0.1-0.2mol/L的NaCl，pH在7.0-7.5之间；

7)将制备好的恩镰孢菌素磁珠连接物保存于储存缓冲液中，储存缓冲液为10-100mmol/L的磷酸缓冲液PBS，pH为7.0-7.5，并且含有0.1-0.2％的牛血清白蛋白和防腐剂；

四、酶结合物的制备，包括以下步骤：

1)将碱性磷酸酶AK和抗体溶液混合后，用透析缓冲液透析，中间换液3次；碱性磷酸酶AK的量为1-5mg，抗体量为1-5mg，其中优选比例为碱性磷酸酶：抗体为2:1；透析缓冲液为10mmol/L的磷酸缓冲液PBS，透析缓冲液的pH为pH7.0-7.5；透析温度优选2-4℃，透析时间优选16-20h；

2)加入一定浓度的戊二醛反应，反应后用透析缓冲液透析，其中换液3次；戊二醛的浓度优选2％-5％，加入体积优选10-20ul，反应温度优选20-25℃，反应时间优选1-2h；透析缓冲液的pH为pH7.0-7.5；透析温度优选2-4℃，透析时间优选16-20h；

3)换用5-10mmol/L的pH7.5-8.0的Tris-HCl缓冲液透析，透析温度优选2-4℃，透析时间优选16-20h，期间换液3次；

4)取出标记抗体放于抗体储存缓冲液中，储存缓冲液为10-100mmol/L的Tris缓冲液，pH为7.0-7.5，并且含有0.1-0.2％的牛血清白蛋白和防腐剂；得恩镰孢菌素抗体-碱性磷酸酶结合物；

五、化学发光底物的配制：

3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)浓度为1-2mmol/L，含十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)0.01-0.1mmol/L，pH为9.0-9.5；

六、清洗液的配制：

为10-50mmol/L的Tris缓冲液，含0.1-0.2％的Tween-20，pH7.5-8.0。