[发明专利]一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷D的方法

说明书

本发明公开了一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷D的方法，属于生物催化合成领域。本发明通过挖掘得到一种具有催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D活性的糖基转移酶，并通过定向进化得到高催化活性突变体YojK‑I241T/G327N。并将糖基转移酶突变体YojK‑I241T/G327N与来源于拟南芥的蔗糖合酶AtSuSy构建偶联反应，实现以莱鲍迪苷A为底物高效催化合成莱鲍迪苷D，以19.32g/L(20mmol/L)Reb A为底物反应15h，高效合成20.59g/L的Reb D，Reb D产率达到91.29％，为莱鲍迪苷D的生产提供了一条高效且绿色的新途径。

技术领域

本发明涉及一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷D的方法，属于生物催化合成领域。

背景技术

由于高热量糖类的过量摄入导致世界范围内严重的过度肥胖、糖尿病、高血压和心脑血管等疾病。因此，来自甜叶菊的甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低且安全性高而受到广泛关注。其中，含量较为丰富的甜菊糖、莱鲍迪苷A等作为甜味剂已广泛应用于饮料、食品等领域。它们具有相较于蔗糖250-300倍的甜度，但是口感上存在甜味之外的苦后味严重影响它们作为甜味剂的口感。而在甜菊糖苷中含量较少的莱鲍迪苷D(Reb D)相较于莱鲍迪苷A(Reb A)和甜菊糖具有更高的甜度，并且减少了甜味之外的苦后味而因此作为甜味剂具有更好的口感，被认为是非常具有潜力的下一代甜味剂。然而，Reb D其在甜叶菊干叶中的含量仅为0.4％-0.5％，仅为Reb A含量的十分之一左右，这也使得通过传统的叶片提取Reb A的方法并不适用于Reb D的提取。繁琐且复杂的提取方法使得仅从甜叶菊叶子中提取难以实现规模化生产，也难以满足市场需求。

目前，通过酶催化方法以甜叶菊中含量较高的Reb A为底物催化合成Reb D被认为是一种可行的提高Reb D生产量的技术路线。通过相关科学家不断探索和挖掘，与以Reb A为底物合成Reb D相关的糖苷转移酶(EUGT11、UGT91D2、UGTSL2)已被挖掘和鉴定。并且通过大肠杆菌等微生物实现这些糖基转移酶的异源表达和Reb D的异源生物合成。然而，这些植物来源的糖苷转移酶在微生物中尤其是原核微生物中异源表达时主要以包涵体的形式存在且酶活较低。反应体系中常采用全细胞催化，需要额外添加细胞通透剂等化学试剂，不够绿色环保。这些缺点限制了糖苷转移酶在Reb D异源生物合成中的应用，使其难以实现规模化生产。因此，挖掘在大肠杆菌等原核微生物中能够较好的可溶性表达，并且具有较高催化活力的糖苷转移酶以实现以Reb A为原料合成Reb D的规模化生产满足市场需求具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明挖掘来自枯草芽孢杆菌BS168的糖苷转移酶YojK催化RebA合成Reb D，该酶在大肠杆菌中能够实现可溶性高效表达，并且在尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)存在的情况下具有催化Reb A合成Reb D的活性。通过基于蛋白质结构的定向进化，成功获得高效突变体，并通过构建尿苷二磷酸葡萄糖UDPG循环体系，利用大肠杆菌裂解液实现高效生物合成Reb D，为Reb D生物合成提供一种新的方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种糖基转移酶，为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列并且具有催化莱鲍迪苷A为莱鲍迪苷D的酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶的基因。

本发明的第三个目的是提供携带编码上述糖基转移酶的基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供表达上述糖基转移酶的重组菌。

在一种实施方式中，所述重组菌还表达蔗糖合酶。