[发明专利]一种秀丽线虫在检测纳米塑料和纳米银世代联合毒性中的应用

权利要求书

1.一种秀丽线虫在检测纳米塑料和纳米银世代联合毒性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将同步化后同一时期秀丽隐杆线虫暴露于含有纳米材料的液体培养基中，根据亲代以及子代秀丽线虫的发育情况评价纳米材料的世代毒性影响，所述纳米材料为纳米塑料和纳米银。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，使用裂解液裂解产卵期秀丽线虫得到足够的虫卵，培养18～22h后将孵化至L1期的线虫转入空白对照组培养基、单独暴露实验组培养基和联合暴露实验组培养基中分别进行染毒实验，取部分亲代即G0代线虫进行指标测定，暴露期结束后将剩余G0代线虫转入含有大肠杆菌的线虫生长培养基中恢复并产卵获得下一代，重复上述操作进行F1、F2、F3代暴露实验，根据每代线虫的发育情况检测纳米银和纳米塑料在连续多代暴露条件下的毒性效应。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述空白对照组培养基包括中等硬度再生水(MHRW)和大肠杆菌；

所述单独暴露实验组培养基包括纳米银和纳米塑料中的一种、MHRW和大肠杆菌；

所述联合暴露实验组培养基包括MHRW、大肠杆菌、纳米银和纳米塑料。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述中等硬度再生水(moderately hardreconstituted water,MHRW)含96mg/L NaHCO₃，60mg/L CaSO₄，60mg/L MgSO₄，4mg/L KCl；所述大肠杆菌为尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(E.coli OP50)。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述纳米塑料选自纳米聚苯乙烯；所述纳米塑料在单独暴露实验组培养基和联合暴露实验组培养基中的浓度为1～10000μg/L；

所述纳米银选自柠檬酸包被的水溶性银纳米颗粒；

所述纳米银在单独暴露实验组培养基和联合暴露实验组培养基中的浓度为10～100μg/L。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述裂解液包括0.5～5M NaOH和20～100％NaClO；

所述暴露期为L1期后96h。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述世代毒性效应检测具体为：

F1代与G0代相比任一项测定指标差异有统计学意义(P0.05)时，纳米材料有明显世代蓄积毒性；

F1代与G0代相比各测定指标差异均无统计学意义(P0.05)，F2代与G0代相比任一项测定指标差异有统计学意义(P0.05)时，纳米材料有较强世代蓄积毒性；

F1代和F2代与G0代相比各测定指标差异均无统计学意义(P0.05)，F3代与G0代相比任一项测定指标差异有统计学意义(P0.05)时，纳米材料有轻微世代蓄积毒性；

所述纳米塑料和纳米银联合毒性影响的检测具体为：

联合暴露组与纳米银单独暴露组相比测定指标差异无统计学意义(P0.05)时，纳米塑料对纳米银毒性效应无影响；

联合暴露组与纳米银单独暴露组相比测定指标差异有统计学意义(P0.05)时，纳米塑料对纳米银毒性效应有影响。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发育情况包括体长、怀卵数、后代数、世代时间、生殖细胞凋亡数、卵母细胞发育情况中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述线虫体长的测定具体为：L1期秀丽线虫暴露96h后，收集部分线虫并清洗，将线虫置于60℃下水浴10min，取出线虫转移至固体培养基，用CCD相机通过体视显微镜捕获线虫图片，使用Image J对线虫成虫体长进行测定，从线虫头部出发，沿其身体中线画折线，至线虫尾部止，折线总长即为线虫体长；

所述线虫怀卵数的测定具体为：L1期秀丽线虫暴露72h后，收集部分线虫并清洗，将线虫转移至固体培养基中，使用裂解液裂解怀卵线虫，对每条线虫体内虫卵进行计数；

所述线虫后代数的测定具体为：L1期秀丽线虫暴露60h后，收集部分线虫并清洗，将线虫转移至固体培养基恢复并自然产卵，每天转移成虫至新的培养板，对固体培养基上孵化出的幼虫进行计数，重复上述操作至线虫成虫不再产卵，每条线虫产出的可以成功孵化的幼虫数为后代数；

所述线虫世代时间的测定具体为：L1期秀丽线虫暴露96h后，收集部分线虫并清洗，将线虫成虫转移至固体培养基恢复并产卵20～24h，用裂解液进行同步化处理后得到线虫虫卵，从同步化得到线虫虫卵到卵发育成成虫开始产卵的时间为世代时间；

所述线虫生殖凋亡细胞数的测定具体为：L1期秀丽线虫暴露74～80h后，收集部分线虫并清洗，用荧光染色剂染色45～80分钟后转移至固体培养基在暗处恢复30～50min，在荧光显微镜下观察并记录线虫单侧生殖腺中细胞凋亡个数；所述染色剂为吖啶橙；

所述线虫卵母细胞发育情况的测定具体为：L1期秀丽线虫暴露96h后，收集部分线虫并清洗，将线虫成虫转移至固体培养基恢复至产卵结束，用固定液固定后在光学显微镜下观察线虫卵母细胞形态并拍照，应用ImageJ对照片中线虫纳精囊旁侧第2位卵母细胞进行长度测量，将实验组和对照组相比，取相对长度作为判定卵母细胞发育情况的指标；所述固定液为4％多聚甲醛。