[发明专利]一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法

说明书

本发明公开了一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法。该方法利用聚电解质纳米胶囊固定化酶代替常规的酶载体与大肠杆菌O157:H7抗体结合，偶联复合物作为标记抗体执行双抗夹心ELISA，建立了基于capsule@HRP的酶联免疫吸附试验检测大肠杆菌O157:H7的方法，通过纳米胶囊包埋大量的游离酶，因此具有更高的显色信号，可有效提高检测灵敏度。本发明不仅完成了纳米胶囊对酶固定化和增强生物传感器性能的精细评价，也为其他酶固定化平台的评价提供了模板。

技术领域

本发明涉及抗原检测技术领域，具体涉及一种灵敏检测大肠杆菌O157H7的酶联免疫 方法。

背景技术

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，又称大肠杆菌，是一种杆状的兼性厌氧革兰 氏阴性菌。大部分大肠杆菌是存在于人和动物肠道内的正常菌群，其中一小部分是致病性的， 人感染后会引起腹泻甚至溶血性尿毒症综合征。危害最大的是能产生志贺毒素的出血性大肠 杆菌，它会导致恶心、呕吐甚至出血性肠炎等，相关的亚型有O26:H11、O91:H21、O111:H8、 O157:NM和O157:H7。

食源性致病菌的检测方法多种多样，传统的检测方法主要分为三类：培养和菌落计数 法、免疫分析法和分子生物学方法。分子生物学以及免疫学检测方法因其简单快速已广泛 替代传统培养法用于食源性致病菌的早期筛查与监测。然而，由于分子生物学的前处理较 复杂、操作过程技术要求较高，需要专业的技术人员且仪器设备昂贵，较难在大量食品样 品的筛查检测中应用。免疫学检测方法因其简单快速、结果判读简单、无需昂贵设备、操 作简便以及技术难度小等优点而倍受研究者的亲睐。

其中酶联免疫吸附试验(ELISA)是检测分析的重要手段之一，广泛应用于食品安全、 环境监测和临床诊断。酶作为限制常规ELISA灵敏度的关键因素而备受关注。酶是一种具 有催化效率高、成本低、化学选择性等优点的生物催化剂。但是酶的应用仍然受到操作和 储存稳定性不理想、对环境条件敏感性高等阻碍。因此，迫切需要探索在有限空间内获得 最佳酶性能的新平台以应对这些挑战。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的方法， 以解决现有技术中针对大肠杆菌O157:H7的检测方法灵敏度较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对大肠杆菌O157:H7的双抗夹心ELISA 法因显色底物发光性能不佳而导致检测灵敏度较低。

本发明要解决的再一技术问题是以期通过制备酶包裹效率高的聚电解质纳米胶囊替代 酶载体来执行双抗夹心ELISA、以检测大肠杆菌O157:H7含量的方法中，提高发光信号和 检测灵敏度。

本发明的第一个目的是提供一种负载酶的聚电解质纳米胶囊，所述的负载酶的聚电解 质纳米胶囊是通过以下方法制备得到：

(1)通过共沉淀法将酶封装在可溶解的碳酸钙纳米颗粒中：将氯化钙溶液和聚苯乙烯 磺酸钠溶液混合，搅拌下进行反应，然后加入碳酸钠溶液和酶溶液，搅拌下继续反应，反 应结束后，离心，将沉淀用超纯水重悬，加入聚丙烯胺盐酸盐溶液，超声，震荡反应，离心，将沉淀用超纯水洗涤，得到沉淀；

(2)将步骤(1)得到的沉淀复溶于乙二胺四乙酸二钠溶液，溶解去除碳酸钙核，离心，将沉淀复溶于PBS溶液中制得负载酶的聚电解质胶囊。

进一步的，步骤(1)中，所述的氯化钙溶液、聚苯乙烯磺酸钠溶液、碳酸钠溶液、酶溶液和聚丙烯胺盐酸盐溶液的体积比为1:0.5:1:1:0.2；所述的氯化钙溶液浓度为4.44mg/mL， 聚苯乙烯磺酸钠溶液浓度为50mg/mL，碳酸钠溶液浓度为4.24mg/mL，酶溶液浓度为2mg/mL，聚丙烯胺盐酸盐溶液浓度为30mg/mL；

上述氯化钙溶液、聚苯乙烯磺酸钠溶液、碳酸钠溶液、酶溶液和聚丙烯胺盐酸盐溶液 配制所用的溶剂均为乙二醇和水混合溶液(体积比为1:4)。