[发明专利]一种脱氢酶突变体L283V/L286V及其制备方法和应用

说明书

一种脱氢酶突变体L283V/L286V及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域；所述突变体L283V/L286V的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示；为将氨基酸序列为如SEQ ID NO：3所示的脱氢酶的第283位和第286位的的亮氨酸同时突变为缬氨酸。脱氢酶突变体L283V/L286V在全细胞体系催化麦斯明还原反应生成S‑去甲烟碱中展示出高度选择性，且同时具有较的高脱氢酶和亚胺还原酶活性，酶还原时间短，转化率高。反应获得的产物S‑去甲烟碱具有极高的光学纯度，降低后续纯化工作难度。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种脱氢酶突变体L283V/L286V及其制备方法和应用。

背景技术

尼古丁（nicotine），俗称烟碱，是茄科植物烟草中所持有的生物碱，占烟草中全部生物碱的95%以上，其化学名为1-甲基（2-吡啶基）吡咯烷，分子式为C₁₀H₁₄N₂，是具有较强碱性的有机二元弱碱，能和多种无机酸或有机酸生成结晶的单盐或双盐，在烟叶中多以有机盐形式存在。

烟碱的用途十分广泛，烟碱系列农药属植物杀虫剂，因其具有蒸薰、胃毒、触杀功能及迅速降解无残留等特点广泛用于粮食、油料、蔬菜、水果、牧草等农作物的杀虫剂，是生产绿色食品的理想高效杀虫剂和生物性农药。它还广泛应用于医药工业上，是研制治疗心血管、皮肤病、蛇毒等疾病药物的特种原料。在临床研究中，尼古丁还对预防并治疗老年痴呆症（Alzheimer’s disease, AD）和帕金森氏综合症（Parkinson’s disease, PD）起积极作用。一些实验和临床结果显示，尼古丁可以影响AD中神经纤维缠结改变的程度，通过皮下和静脉给药可以改善AD病人的认知障碍，尤其是信息加工能力和短期记忆能力。

目前市场上使用的天然尼古丁（S-尼古丁）主要还是依赖植物提取的方式，其中包括微波法、超声波提取法、超临界萃取法等。但是，植物提取的方法效率低，而且因为受到原材料、气候和生长周期等多方面的影响，提取尼古丁的过程中还会含有烟草特有的尼古丁相关杂质，这类杂质的长期使用会对健康产生潜在危害，通过植物提取获得的尼古丁还需要一系列纯化步骤才能获得高纯度的S-尼古丁。因此，高效合成高纯度S-尼古丁的制备方法被广泛关注。

S-去甲烟碱（S-nornicotine）是合成S-尼古丁的重要前体物质，S-去甲烟碱只需要一步甲基化反应即可生成S-尼古丁，而高光学纯度的S-去甲烟碱是合成高纯度S-尼古丁的保证。

酶是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的一种生物催化剂；酶的高效性和专一性，使其在合成高纯度化合物中得到广泛应用。随着分子生物学、蛋白质工程等相关技术逐渐成熟，酶催化机理的解读手段以及酶的设计技术越来越丰富，利用生物酶法完成高光学纯度S-去甲烟碱的合成是一种值得研究的方向。蛋白质工程理性设计是以定点突变技术为主要手段，根据对蛋白质结构与功能关系地了解，有目的地设计改造蛋白质，使其性能达到预期效果。目前，已有大量研究成功利用理性设计技术对天然酶的催化活性、底物特异性、热稳定性以及酶的别构效应等进行改造。随着计算生物学的发展，计算机辅助设计指导酶改造的方法日趋成熟。利用计算机模拟的方法，建立酶的三维结构模型，分析酶与底物的构象关系，快速定位与催化反应相关的区域，缩小突变库容量，高效获得相关靶点，为蛋白质工程改造提供指导。但是目前未发现通过蛋白质工程对酶进行设计和改造，实现利用生物酶法完成高光学纯度S-去甲烟碱的合成的相关研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于设计并提供一种脱氢酶突变体L283V/L286V，用于制备S-去甲烟碱，其底物多样性丰富且产物光学纯度高，且酶解时间短，转化率高。

本发明的目的之二在于提供上述脱氢酶突变体L283V/L286V的制备方法，通过定点突变技术制备脱氢酶突变体L283V/L286V，稳定性高。

本发明的目的之三在于提供上述脱氢酶突变体L283V/L286V在制备高光学纯度的S-去甲烟碱中的应用。