[发明专利]一种大体积、高灵敏度核酸提取方法

说明书

本发明公开了一种大体积、高灵敏度核酸提取方法。本发明的大体积、高灵敏度核酸提取方法，包括向无菌离心管中加入样品；向离心管中加入蛋白酶K试剂、磁珠和裂解液；密封离心管，漩涡振荡混匀，温育，期间不时振荡混匀；将所述离心管放到磁力架上，吸磁弃上清，将磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡以充分混匀；将离心管放置到磁力架上，吸磁弃上清，得到磁珠混合液，将所述磁珠混合液转移至EP管中；将EP管离心，平铺吸磁，弃上清，烘干。本发明的提取方法大大提高了提取的核酸量，有利于提高极低病毒载量样品核酸检测效率，避免漏检。经过验证，本方法检测下限可以达到1IU/ml，大大提高了检测的灵敏度，能够对低病毒载量的标本进行病毒定量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种大体积、高灵敏度核酸提取方法。

背景技术

核酸提取是分子生物学研究的重要基础。一般来说，成功的核酸提取需要四个重要的步骤：有效地破坏细胞或组织、核蛋白复合物的变性、核酸酶的失活和远离污染。提取出的核酸的质量、完整性和数量将直接影响所有后续科研的结果。

目前，国内外采供血机构在用的核酸检测(Nucleic Acid Test,NAT)方法及系统都是从几百微升到1ml中提取病毒核酸进行检测，但对于很多病毒载量低的标本，并不能有效提取出足够量的核酸，直接影响检测结果，影响临床用血安全。已有报道的针对低病毒载量标本的核酸提取方法有PEG富集法和超高速离心法。其中PEG富集法需要4℃过夜，而超高速离心法需要在4℃、250 000g条件下离心3h，这两种方法耗时长、对设备要求高，难以普及应用。

另一方面，目前核酸检测方法的检测下限是影响临床用血安全的关键点。以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)为例，受核酸检测的检测下限限制，目前仍不能完全检出病毒载量极低的HBV献血者，如隐匿性HBV感染(occult hepatits B virus infection，OBI)。OBI是一种特殊形式的HBV感染，OBI患者体内HBV DNA往往处于极低水平，严重威胁着血液安全。Jos Weusten构建了OBI输血残余风险的数学模型显示，约有3.3％的OBI献血者是目前核酸检测无法检测到的，并且20ml该OBI献血者的血液制品即可造成受血者感染；当使用混样核酸检测时，这一比例更是高达8.7％。2016年Ryanne的研究也表明，接受来源于OBI献血者血液制品的受血者HBV感染率约为5％。2018年Daniel报道了3名HBsAg阴性，HBVDNA阴性献血者造成31名受血者中有9人感染的病例，进一步证实了HBV DNA的最小感染病毒载量为3IU，而要达到完全的临床用血安全需要将HBV DNA检测下限提高到0.15IU。这与目前核酸检测4.3IU/mL(盖立复核酸检测系统)和4.1IU/ml(罗氏MP6-NAT核酸检测系统)的检测下限相比，还有较远距离。因此提高NAT检测下限，提高检测灵敏度，对于保证临床用血安全具有重大意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种具有能够完全提取大体积标本核酸且灵敏度高等特点的大体积、高灵敏度核酸提取方法。

一种大体积、高灵敏度核酸提取方法，包括：

S1：向离心管中加入样品；

S2：向所述离心管中加入蛋白酶K试剂、磁珠和裂解液；

S3：密封所述离心管，漩涡振荡混匀，温育，期间不时振荡混匀；

S4：将所述离心管放到磁力架上，吸磁弃上清，将磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡以充分混匀；

S5：将步骤S4中混匀后的离心管放置到磁力架上，吸磁弃上清，得到磁珠混合液，将所述磁珠混合液转移至EP管中；

S6：将EP管离心，平铺吸磁，弃上清，烘干；

S7：往EP管内加入预热后的洗脱液，反复吹打，充分悬浮磁珠，保温静置，期间混匀多次；