[发明专利]一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物和方法

说明书

本发明公开了一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物和方法，属于植物病害检测技术领域。本发明所用引物基于芜菁花叶病毒CP基因序列AB701704、KC119189和AP017831保守区域设计，所述引物如下：上游引物TuMV‑F:5’‑CGACCATACATGCCACGACA‑3’，下游引物TuMV‑R：5’‑TCCATCCAAGCCGAACGAA‑3’，无论是RT‑PCR还是RT‑qPCR扩增均可用此引物。用于定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，包括以下步骤：提取勿忘我感病叶片总RNA；将总RNA反转录成cDNA，一次为模板进行普通PCR和实时荧光定量PCR。本发明设计的引物灵敏度高、特异性强、重复度好，本发明建立了一套能快速灵敏检测芜菁花叶病毒的方法，可为勿忘我TuMV的早期监测和预警提供技术支持。

技术领域

本发明属于植物病害检测技术领域，具体地说，涉及一种快速定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物和方法。

背景技术

勿忘我又名杂种补血草(Limonium sinuatum)。该种花色丰富，有紫、粉、白、蓝、黄等多种颜色，观赏性较高，其花瓣呈蜡质，可用作鲜切花和干花，在世界各地广泛种植。自1991年将勿忘我引入昆明栽培后，勿忘我产业迅速发展，已成为云南省花卉栽培产业的主力军之一。目前，大批量生产的勿忘我主要来自于组织培养，病毒在多次继代培养中不断积累，大大制约了勿忘我产业的发展。病毒病的频繁发生导致勿忘我种质退化，产量和品质大不如前。采用高效、准确的检测方法对勿忘我病毒进行及时诊断，是解决勿忘我产业发展问题的关键。

国内外关于补血草属植物病毒的报道主要集中在上世纪90年代。陈燕芳等报道了勿忘我上存在蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)侵染，张仲凯记载了一种云南昆明地区发生的“勿忘我皱缩病”，经电镜负染后，观察到球形病毒粒体(直径约20nm)，但目前仍不清楚其具体病原。据国外的一些报道，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus，ClYVV)、补血草病毒(Statice virusY，StaVY)、芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiensnecrotic spot virus，INSV)和葡萄属阿尔及利亚潜伏病毒(Grapevine Algerian latentvirus，GALV)均能侵染补血草。近年来，在云南昆明勿忘我主栽区(云南省晋宁县和宜良县等地)，多次发现勿忘我新型病株，主要表现出典型的病毒病症状，如矮化、叶片皱缩、花叶等。在此之前，本发明人已通过酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)以及普通RT-PCR对采自云南昆明勿忘我主栽区的感病植株进行了病毒种类的检测，发现云南勿忘我主栽区主要存在TuMV侵染。

TuMV隶属于马铃薯Y病毒科，有文献报道，TuMV可侵染多达43科156属的300多种植物，其寄主范围非常广泛，自然条件下，主要通过蚜虫或植株的汁液传播。植株一旦感病，便难以恢复正常的生长。因此，在勿忘我种苗生产中对其进行及时有效的检测具有非常重要的意义。当前用于病毒检测的常用方法主要有生物学、显微形态观察、免疫学、分子生物学等方法。生物学方法存在周期长，操作繁琐的问题，且待植物表现出相应的症状时，已造成无法挽救的伤害。显微观察的方法能直观的看到病毒粒体，但操作相对复杂，且耗时较长。免疫学方法如ELISA则存在灵敏度低、特异性差等特点。普通PCR只能对病毒进行定性或半定量分析，不能排除假阳性的结果的出现。荧光实时定量PCR(real-time fluorescencequantitative PCR)是一种新的病毒检测技术，具有良好的发展前景。采用该方法，可实现病毒的定量检测，并且灵敏度较高。但目前还没有TuMV实时荧光定量PCR检测方法的相关技术研究及应用报道。

发明内容